여기에서는 세포에서 단일 가닥 DNA의 수준을 정량화하는 면역형광 기반 방법을 설명합니다. 이 효율적이고 재현 가능한 방법은 여러 난소암에서 흔히 볼 수 있는 특징인 복제 스트레스를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 이 분석은 자동화된 분석 파이프라인과 호환되어 효율성을 더욱 높입니다.
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이 논문에서
요약
초록
복제 스트레스는 여러 난소암의 특징입니다. 복제 스트레스는 이중 가닥 절단, 전사-복제 충돌 또는 증폭된 종양 유전자를 포함한 여러 소스에서 나타날 수 있으며, 필연적으로 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 생성을 초래합니다. 따라서 ssDNA를 정량화하면 다양한 세포 유형과 다양한 DNA 손상 조건 또는 치료에서 복제 스트레스 수준을 평가할 수 있습니다. 새로운 증거는 또한 ssDNA가 DNA 복구를 표적으로 하는 화학요법 약물에 대한 반응의 예측 인자일 수 있음을 시사합니다. 여기에서는 ssDNA를 정량화하기 위한 상세한 면역형광 기반 방법론을 설명합니다. 이 방법론은 티미딘 유사체로 게놈을 표지한 다음 비변성 조건에서 염색질에서 유사체의 항체 기반 검출을 포함합니다. ssDNA의 스트레치는 형광 현미경으로 초점으로 시각화할 수 있습니다. 병소의 수와 강도는 핵에 존재하는 ssDNA의 수준과 직접 관련이 있습니다. 또한 ssDNA 신호를 정량화하기 위한 자동화된 파이프라인에 대해서도 설명합니다. 이 방법은 빠르고 재현 가능합니다. 또한 이 방법론의 단순성으로 인해 약물 및 유전자 스크리닝과 같은 고처리량 응용 분야에 적합합니다.
서론
게놈 DNA는 다양한 내인성 및 외인성 출처의 여러 공격에 자주 노출된다1. 내인성 손상의 빈도는 난소암을 포함한 여러 암 유형에서 본질적으로 더 높은 활성산소종 또는 알데히드와 같은 대사 부산물의 수준과 직접적인 상관관계가 있다 2,3. DNA 손상을 효율적으로 해결하는 것이 필수적입니다. 그렇지 않으면 유전 독성 병변을 조장하여 결과적으로 돌연변이 유발을 일으킬 수 있습니다. 유전독성 병변을 복구하는 세포의 능력은 오류 없는 DNA 복구 경로의 기능과 DNA 손상에 대한 반응으로 세포 주기 진행의 효율적인 조절에 달려 있습니다. 특히, 많은 난소암은 p53에 기능적으로 비활성화 돌연변이를 가지고 있으며, 따라서 결함이 있는 G1/S 체크포인트를 가지고 있어 복구되지 않은 게놈 병변이 있음에도 불구하고 세포가 DNA 복제를 시작하도록 유도합니다 4,5. 난소암의 DNA 손상 정도는 고급 장액성 난소암(HGSOC)의 50% 이상이 BRCA1 및 BRCA2 매개 상동 재조합, 오류 없는 DNA 복구 경로에 결함이 있고 약 20%가 유전자
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프로토콜
참고: 난소암 세포주인 OVCAR3이 이 단계에서 사용되었지만 이 프로토콜은 비난소 공급원에서 파생된 세포주를 포함하여 여러 다른 세포주에 광범위하게 적용할 수 있습니다. 프로토콜의 개략도는 그림 2에 나와 있습니다.
1. 셀 도금
- 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립을 만듭니다.
- 폴리-L-라이신 용액이 담긴 12mL 원뿔형 튜브에 오토클레이브 50mm 직경 커버슬립을 추가하고 로커에 15분 동안 놓습니다.
- 조직 배양 후드에서 용액을 흡인합니다. 멸균수를 추가하여 커버슬립을 세척하고 커버슬립이 들어 있는 튜브를 로커에 5분 동안 다시 놓습니다. 이 세척 단계를 세 번 반복하십시오.
- 코팅된 커버슬립을 멸균 접시에 펼치고 남아 있는 물을 흡인합니다. 커버슬립을 조직 배양 후드에서 1시간 동안 또는 물방울이 남지 않을 때까지 건조시킵니다. 건조되면 접시를 파라필름으로 밀봉하고 4°C에 둡니다.
- 하나의 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립을 24웰 플레이트의 각 웰에 놓습니다. 폴리 라이신 커버슬립의 사용은 사전 추출 단계 동안 커버슬립에서 세포가 분리되는 것을 방지하는 데....
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결과
24시간 동안 0.5 mM 하이드록시우레아로 처리된 미처리 세포 및 세포로부터 유래된 핵으로부터의 IdU 초점의 대표 이미지 및 정량화가 도 4에 제시되어 있다. 두 핵 모두 염색되어 DAPI 채널에서 식별 가능합니다. 이 이미지의 분석은 각 핵의 초점 수를 정량화하는 것으로 구성됩니다. 초점의 수는 복제 스트레스의 정도에 비례합니다.
그림 1: ssDNA 생성 메커니즘. 세포에서 ssDNA가 생성될 수 있는 다양한 메커니즘을 보여주는 개략도. 여기에는 (A) 복제 기계의 스톨, (
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토론
프로토콜에서 언급했듯이 분석이 작동하는지 확인하기 위해 몇 가지 실험 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 여기에는 IdU 처리되지 않은 샘플과 1차 항체 처리되지 않은 샘플이 포함됩니다. 두 음성 대조군 모두 DAPI에 의해 염색되었지만 IdU 신호를 포함하지 않는 세포를 생성해야 합니다.
사용된 실험 조건 및 세포주에 따라 최상의 형광 신호를 얻기 위해 다양한 항체 희석이 필요할 수 있습니다. 신호가 너무 많으면 개별 초점을 정량화할 수 없는 반면, 신호가 너무 적으면 샘플 간의 실험적 차이를 식별할 수 없습니다. 추출 전 및 투과화 시간을 조정하면 추출되지 않은 핵질 내용물에서 발생할 수 있는 배경 신호가 너무 많은 경우에도 도움이 될 수 있습니다.
이 프로토콜은 두 개의 개체군 배가에 걸쳐 IdU 통합이 필요하기 때문에 각 세포주의 배가 시간을 고려하는 것이 중요합니다. 배가 시간이 다른 두 세포주를 비교할 때 각 세포주의 .......
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감사의 글
PV는 The Foundation for Barnes-Jewish Hospital을 통한 Alvin J. Siteman Cancer Center의 Inaugural Pedal the Cause Grant, Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research의 파일럿 연구 보조금, Mary Kay Ash Foundation 및 V-Foundation의 암 연구 보조금의 지원을 받습니다. NR은 세인트루이스 워싱턴 대학교에 대한 NIH 세포 및 분자 생물학 교육 T32 보조금의 지원을 받습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3% 파라포름알데히드(PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10g 자당 + 100mL 10X PBS + 물을 925mL로 만듭니다. 75 mL 40% 메탄올 프리 PFA를 첨가하고, 혼합하고, 보관하기 전에 50 mL의 부분 표본을 만듭니다 보관: -20°C에 보관; C |
| 5-요오도-2'-데옥시우리딘(IdU) | 시그마 알드리치 | I7125-5G | MW = 354.10g/mol. 10 mM 재고의 경우: 3.541 mg IdU를 1 mL 1 N 액체 암모니아 용해 저장: -20 °에 보관; C |
| Anti-BrdU 항체 | BD Biosciences | 347580 | 저장 : 4 °C에 보관; C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 2차 항체 | Thermo Scientific | A32766 | 감광성 - 어두운 곳에 보관 보관: 4°C에 보관; C |
| 둔감한 혈청 알부민 (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | PBS의 양에 특정한 질량을 추가해서 만드는 저장: 4개의 °에 있는 저장; C |
| 원형 커버 유리 | 전자 현미경 과학 | 72230-01 | |
| NIS GA3 소프트웨어 | 니콘 | ||
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | 성장 매체: L-글루타민, 0.01 mg/mL 소 인슐린이 보충된 RPMI; 최종 농도 20%까지의 소 태아 혈청 및 1X Pen Strep 저장: 동결 매체: 성장 매체 + 5% DMSO 및 -80°에 보관; C |
| Poly-L-Lysine 솔루션 | Sigma Aldrich | P4832-50ML | 저장: 4°C에 보관; |
| C ProLong 다이아몬드 안티페이드 마운트란트와 DAPI | Thermo Scientific | P36962 | 저장: 4도에 보관; C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | 저장: 4°C에 저장; C |
| 물, 멸균 여과 | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | 저장: 4°C에 보관; 씨 |
참고문헌
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamen....
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재인쇄 및 허가
