방법 논문

소변에서 유래한 영장류 유도 만능줄기세포의 생성 및 유지

DOI:

10.3791/64922

⸱

2023년 7월 28일

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biology, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology, Kyoto University, 3Hakubi Center, Kyoto University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 프로토콜은 인간 및 비인간 영장류 소변 유래 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 분리, 확장 및 재프로그래밍하는 방법과 새로 생성된 iPSC의 피더 없는 유지 관리에 대한 지침을 설명합니다.

초록

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영장류 만능 줄기 세포와 그 유도체를 연구하는 종 간 접근법은 질병, 발달 및 진화의 분자 및 세포 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 영장류 유도만능줄기세포(iPSC)에 보다 쉽게 접근할 수 있도록 하기 위해 본 논문에서는 소변 유래 세포에서 인간 및 비인간 영장류 iPSC를 생성하는 비침습적 방법과 피더 프리 배양 방법을 사용한 유지 관리를 제시합니다.

소변은 비멸균 환경(예: 동물의 케이지)에서 샘플링하고 1차 세포 배양 중에 광범위한 항생제 칵테일로 처리하여 오염을 효율적으로 줄일 수 있습니다. 소변 유래 세포의 증식 후, iPSC는 상업적으로 이용 가능한 센다이 바이러스 벡터 시스템의 변형된 형질도입 방법에 의해 생성됩니다. 첫 번째 iPSC 콜로니는 이미 5일 후에 볼 수 있으며 빠르면 10일 후에 채취할 수 있습니다. 효소가 없는 해리 완충액을 사용한 일상적인 덩어리 계대배양은 50개 이상의 계대에 대해 생성된 iPSC의 다능성을 지원합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간과 비인간 영장류(NHP)의 게놈 비교는 우리의 진화 역사와 인간 특이적 형질의 진화를 이해하는 데 중요합니다1. 추가적으로, 이러한 비교는 보존된 DNA 서열2을 식별함으로써, 예를 들어, 질병 관련 변이체3의 우선순위를 정함으로써 기능의 추론을 가능하게한다. 유전자 발현 수준과 같은 분자 표현형의 비교는 게놈 비교를 더 잘 해석하고 예를 들어 세포 표현형 차이를 발견하는 데 중요합니다. 또한, DNA 수준에서의 비교와 유사하게 기능적 관련성을 추론할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 따라서 인간 내에서 의학적으로 관련된 변이를 더 잘 해석할 수 있다4. 이러한 비교 연구에 포괄적인 분자 표현형 데이터를 통합하려면 적절한 생물학적 자원(즉, 종 전반에 걸친 상동 세포)이 필요합니다. 그러나 윤리적이고 실용적인 이유로 인해 특히 개발 중에 이러한 유사한 세포에 접근하는 것이 어렵거나 불가능합니다. 유도만능줄기세포(iPSCs)는 시험관 내에서 접근하기 어려운 세포 유형의 생성을 가능하게 하고5,6, 실험적으로 접근가능하며, 영장류 비교에 사용되어 왔다6,7,8,9,10,11,12,13,14.

iPSC를 생성하려면 다시 프로그래밍할 1차 셀을 획득해야 합니다. 소변에서 분리된 세포는 영장류로부터 비침습적으로 샘플링할 수 있고, 줄기세포와 유사한 분자 프로파일로 인해 쉽게 재프로그래밍할 수 있다는 장점이 있다15. 영장류 iPSC를 유지하기 위한 배양 조건은 재프로그래밍만큼 중요합니다. 일반적으로 인간 만능 줄기 세포의 배양에는 필수 영양소와 배아 줄기 세포(ESC)를 위한 스캐폴드를 제공하는 정의되지 않은 혈청 기반 배지와 마우스 배아 섬유아세포(소위 영양세포)의 공동 배양이 필요했습니다16. 화학적으로 정의되고 피더가 없는 배양 시스템(17,18)의 개발 이후, 현재 상업적으로 이용 가능한 iPSC 배양 배지 및 매트릭스의 다양한 옵션이 있습니다. 그러나 이러한 배양 조건의 대부분은 인간 ESC 및 iPSC에 최적화되어 있으므로 NHP iPSC 배양에서는 잘 작동하지 않을 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜에서는 소변 세포 배양에서 파생된 인간 및 NHP iPSC를 생성하고 유지하기 위한 지침을 제공합니다.

2006년 섬유아세포에서 정의된 인자의 강제 발현에 의한 iPSC 생성이 처음 보고된 이후, 이 방법은 다양한 기원의 다양한 세포 유형에 적용되었습니다 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. 그 중에서도 소변 유래 세포만 완전히 비침습적으로 얻을 수 있습니다. 앞서 기술한 Zhou et al.33의 프로토콜에 따르면, 광범위한 항생제를 보충함으로써 비멸균 샘플에서도 영장류의 소변에서 세포를 분리하고 확장할 수 있다15. 특히, 이 프로토콜에 의해 샘플링된 소변 유래 세포는 섬유아세포의 기존 재프로그래밍(20-30일, 우리의 경험에서)보다 더 짧은 기간(콜로니가 5-15일 후에 볼 수 있음) 내에 iPSC를 생성할 수 있는 높은 잠재력을 나타내며 충분히 높은 성공률로 나타납니다. 이러한 소변 유래 세포는 중간엽 줄기세포 유사 세포와 방광 상피 세포의 혼합 집단으로 분류되어 높은 재프로그래밍 효율을 일으켰다(15).

1차 셀의 변화 외에도 iPSC를 생성하는 재프로그래밍 방법도 사용 목적에 따라 다릅니다. 인간 체세포에 대한 종래의 재프로그래밍 절차는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 이용한 재프로그래밍 인자의 과발현에 의해 수행되었으며, 이는 게놈 5,34,35에서 외인성 DNA의 통합을 허용하였다. 생성된 iPSC를 게놈적으로 온전하게 유지하기 위해 연구자들은 절제 가능한 PiggyBac 벡터 36,37, 에피솜 벡터38,39, 센다이 바이러스 40 및 아데노바이러스 41과 같은 비통합 바이러스 벡터, mRNA 형질감염 42, 단백질 형질감염 43,44 및 화학 화합물 처리 45. 효율성과 취급 용이성으로 인해 센다이 바이러스 기반 재프로그래밍 벡터가 이 프로토콜에 사용됩니다. 일차 세포의 감염은 플레이팅 전에 5의 감염 다중도(MOI)에서 세포 및 바이러스의 1시간 현탁 배양에서 수행됩니다. 이 변형된 단계는 바이러스가 부착된 세포 배양물에 직접 첨가되는 종래의 방법에 비해 세포 표면과 바이러스 사이의 접촉 가능성을 증가시킬 수 있으며, 따라서 더 많은 iPSC 콜로니를 생성할 수 있다15.

인간 및 NHP 만능 줄기 세포의 계대는 덩어리 계대증 및 단세포 계대증에 의해 수행될 수 있습니다. 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)은 칼슘과 마그네슘 이온을 결합하여 카데린과 인테그린의 부착 활성을 방지하는 비용 효율적인 킬레이트제입니다. EDTA는 또한 미분화 세포가 다른 접착 분자로 인해 분화 된 세포보다 먼저 분리되기 때문에 온화하고 선택적인 해리 시약으로 사용됩니다. 완전한 해리는 단백질 키나아제(Rho/Rock) 매개 미오신 과활성화를 포함하는 Rho/Rho 관련 코일 코일을 통해 영장류 iPSC의 대규모 세포 사멸을 유도합니다. 따라서 배양 배지에 Rho/Rock 억제제를 보충하는 것은 현탁액46,47의 단일 세포가 필요한 실험에 필수적입니다. 이 프로토콜에서는 일상적인 패시징 방법으로 덩어리 패시징을 권장하고 정의된 셀 번호의 시딩이 필요한 경우 또는 하위 클로닝 중에 필요한 경우에만 단일 셀 패시징을 권장합니다.

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프로토콜

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이 실험 절차는 인간 실험에 대한 책임 윤리 위원회(20-122, Ethikkommission LMU München)의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다.
참고: 인간 및 NHP 샘플을 다루는 실험을 시작하기 전에 적절한 윤리 위원회의 승인을 받아야 합니다. 모든 실험 절차는 관련 지침 및 규정에 따라 수행되어야 합니다. 다음 각 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 수행해야 합니다. 모든 완충액 및 배지 조성은 보충표 S1에서 찾을 수 있다. 셀에 첨가하기 전에 모든 배지를 실온(22°C)으로 예열해야 합니다. 각 원심분리 단계는 달리 언급되지 않는 한 실온에서 수행되어야 한다.

1. 소변 샘플에서 세포 분리

주의: 인간 기증자가 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스(HBV) 및 C형 간염 바이러스(HCV)가 없는지 확인하십시오. NHP의 경우 가능한 기증자/세포에 특정 병원체인 B 바이러스(BV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 유인원 베타레트로바이러스(SRV) 및 유인원 T 세포 림프친화성 바이러스(STLV)가 없는지 확인하십시오.

  1. 웰 당 0.2% 젤라틴 500μL를 첨가하여 젤라틴이 코팅된 12웰 플레이트를 준비하고, 플레이트를 움직여 액체를 분배한다. 필요하기 전에 최소 37°C에서 30분 동안 두십시오.
  2. 50mL 원뿔형 튜브에 사람의 소변 샘플을 수집합니다. 영장류의 경우 주사기로 동물 시설 바닥에서 소변을 채취하십시오.
    참고: 5mL의 소변은 시도의 42%에서 적어도 하나의 콜로니를 분리하기에 충분한 것으로 입증되었습니다. 그러나 집락을 분리할 가능성을 높이려면 더 많은 양의 ~50mL의 소변을 사용하는 것이 좋습니다. NHP 소변은 가능한 한 신선하게, 가급적이면 배뇨 직후에 채취해야 합니다. 소변 샘플의 보관은 4°C에서 4시간 동안 프로토콜의 성공률에 부정적인 영향을 미치지 않았지만 더 긴 저장 시간은 테스트되지 않았습니다.
  3. 소변 함유 튜브를 400 × g 에서 10 분 동안 원심 분리하고 상층액을 조심스럽게 흡인하여 튜브에 약 1mL를 남깁니다.
  4. 펠릿을 잔류 액체 1mL에 재현탁합니다. 여러 개의 소변 튜브가 수집 된 경우 하나의 튜브에 현탁액을 모으십시오.
  5. 2.5μg/mL 암포테리신이 포함된 10mL의 소변 세척 완충액( 보충 표 S1 참조)을 튜브에 추가하여 세포를 세척하고 혈청학적 피펫을 사용하여 현탁액을 조심스럽게 혼합합니다.
  6. 튜브를 200 × g 에서 10 분 동안 원심 분리하고 상층액을 조심스럽게 흡인하여 튜브에 약 <0.2 mL를 남깁니다.
  7. 초기에 처리된 소변 50mL당 0.5μg/mL 암포테리신을 함유한 1차 소변 배지 1mL( 보충 표 S1 참조)에 세포 펠릿을 재현탁합니다(50mL 미만의 소변이 처리된 경우에도 1mL로 재현탁).
  8. 웰로부터 젤라틴을 흡인하고(단계 1.1에서 제조됨), 단계 1.7로부터의 현탁액 1 mL를 12-웰 플레이트의 하나의 웰에 플레이트한다. 원하는만큼 우물에 대해 또는 사용 가능한만큼의 현탁액에 대해 반복하십시오.
    선택 사항: 비위생적인 시료 채취로 인한 오염을 방지하려면 여기서부터 첫 번째 계대까지 100μg/mL 항균 시약을 세포에 추가합니다.
  9. 플레이트를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 넣는다.
  10. 기존 배지를 제거하지 않고 5일까지 매일 웰당 1mL의 1차 소변 배지를 추가합니다.
  11. 5일째에 플레이트에서 4mL의 배지를 흡인하고 약 1mL의 배지를 남깁니다. 웰당 1mL의 REMC 배지(보충 표 S1 참조)를 추가하여 새 배양 배지와 1:1 혼합물을 얻습니다.
  12. 첫 번째 콜로니가 나타날 때까지 매일 배지의 절반을 REMC 배지로 교체하십시오(그림 1A, B). 따라서 1mL의 오래된 배지를 제거하고 웰당 1mL의 신선한 REMC 배지를 추가합니다.

2. 비뇨기 세포의 확장

참고: 배양이 90% 밀도에 도달하기 전에 요로 세포 계대배양을 수행해야 합니다.

  1. 단계 1.1에 명시된 바와 같이 원하는 양의 젤라틴 코팅된 12웰 플레이트를 준비합니다.
  2. 기존 배지를 흡인하고 Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS) 1mL를 첨가하여 세포를 세척합니다.
  3. DPBS를 흡인하고 DPBS로 희석된 0.5x 해리 효소 300μL를 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 5분 동안 인큐베이션합니다.
  4. 700 μL의 REMC 배지를 첨가하여 효소 반응을 중지시킨다. 세포가 단일 세포로 해리될 때까지 P1000 피펫을 사용하여 현탁액을 부드럽게 피펫팅합니다.
  5. 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮기고 튜브를 200× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  6. 상층액을 조심스럽게 흡인하고 펠릿을 REMC 배지 1mL에 재현탁합니다.
  7. 세포 계수기(혈구계 또는 자동 세포 계수기)를 사용하여 세포 수를 세십시오.
  8. 비뇨기 세포의 확장을 위해, 1mL의 REMC 배지에 1.5 × 10 내지 3 내지 104 세포를 0.2% 젤라틴으로 코팅된 하나의12-웰 플레이트에 넣× 플레이트.
  9. 배양이 80%-90% 밀도에 도달할 때까지 격일로 후속 배지 교체를 수행합니다. 따라서 기존 배지를 흡인하고 신선한 REMC 배지 1mL를 추가합니다.

3. 센다이 바이러스 벡터 감염에 의한 iPSC의 생성

알림: 재프로그래밍 절차의 워크플로는 그림 2A를 참조하십시오. 재 프로그래밍에 사용되는 비뇨기 세포는 가능한 한 젊어야하지만 4 번 통과 전에는 재 프로그래밍 효율의 현저한 손실이 관찰되지 않습니다. 센다이 바이러스 재프로그래밍 키트는 BL-2 시설에서 사용해야 합니다. 층류가 있는 생물학적 안전 캐비닛 아래에서 바이러스를 처리하고 점막 노출을 방지하기 위해 항상 적절한 안전 장비를 사용하십시오.

  1. 웰 당 500 μL의 기저막 매트릭스를 첨가하여 기저막 매트릭스가 코팅된 12-웰 플레이트를 준비하고, 플레이트를 이동시켜 액체를 분배하였다. 플레이트를 37°C에서 최소 1시간 동안 인큐베이션하고, 기저막 매트릭스를 900μL의 REMC 배지로 교체한다. 사용할 때까지 플레이트를 37°C에서 보관하십시오.
  2. Sendai Reprogramming Kit의 구성 요소를 37°C 수조에서 빠르게 해동합니다. 센다이 바이러스(polycistronic KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC 및 KLF4)를 MOI 5와 혼합하고 REMC 배지를 최대 100μL까지 추가합니다. 방정식 (1)을 사용하십시오.
    바이러스 부피 공식, MOI 방법, 세포 연구 응용 분야를 위한 방정식 계산.
    참고: 바이러스 역가는 로트마다 다르므로 항상 제조업체에서 제공한 분석 인증서에서 역가를 확인하십시오.
    선택 사항: 녹색 형광 단백질(GFP) 센다이 바이러스를 형질도입 효율에 대한 양성 대조군으로 추가로 사용합니다. 이를 위해 3.3 단계에서 별도의 튜브에 3.5 ×10 4 셀을 추가로 준비합니다.
  3. 비뇨기 세포의 해리를 위해서는 2.2-2.4 단계를 따르십시오. 세포 계수기를 사용하여 세포를 세고 7 ×10 4 개의 소변 세포를 1.5mL 튜브에 옮깁니다.
  4. 튜브를 200× g 에서 5분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 3.2단계에서 제조된 SeV 혼합물 100μL에 펠렛을 재현탁합니다. 현탁액 감염을 위해 37°C에서 1시간 동안 튜브를 배양합니다.
  5. 현탁액을 기저막 매트릭스로 코팅된 12-웰 플레이트 상에 플레이트하여 단계 3.1에서 제조하였다. 일상적으로, 플레이트 1 × 10 4 및 2.5 × 104 셀을 웰 당 이중으로 한다.
  6. 세포를 37°C 및 5%CO2에서 인큐베이션한다. 형질도입 후 24시간 및 3일째에 배지를 1mL의 신선한 REMC 배지로 교체합니다.
  7. 형질도입 후 5일째에 배지를 PSC 생성 배지로 변경하고(보충표 S1 참조), 이후 배지를 격일로 교체합니다. 따라서 기존 배지를 제거하고 웰당 1mL의 PSC 생성 배지를 추가합니다.
    참고: 첫 번째 콜로니가 나타날 때까지 최대 15일이 소요될 수 있습니다.
  8. 콜로니의 크기가 1mm를 초과할 때 개별 iPSC 콜로니를 선택합니다. 이렇게하려면 현미경으로 p10 피펫으로 단일 식민지를 긁어 내고 조심스럽게 수집하십시오. 콜로니를 750 μL의 PSC 배양 배지를 함유하는 기저막 매트릭스로 코팅된 12-웰 플레이트의 새로운 웰로 옮깁니다.
    선택 사항: 채취 전에 플레이트를 DPBS로 헹구고 0.5mM EDTA로 1분 동안 처리하면 추가 단계의 강력한 배양을 지원할 수 있습니다. 세포가 나중에 출현하는 콜로니를 기다리기 위해 더 오래 배양되어야 하는 경우, 이 EDTA 처리 단계를 수행하지 마십시오.
  9. 37°C 및 5%CO2 에서 세포를 성장시키고, 프로토콜의 섹션 4에 명시된 바와 같이, 격일로 후속 배지를 교체한다. 선택된 콜로니가 직경 2mm에 도달하면 프로토콜의 섹션 5에 설명된 대로 일상적인 iPSC 통과를 계속합니다.

4. 중간 변화

참고: 배양 배지는 콜로니가 계대배양을 할 수 있을 만큼 충분히 커질 때까지 격일로 교체해야 합니다.

  1. 기존 배지를 흡인하고 12웰 플레이트당 750μL의 새로운 배지를 추가합니다. 다른 유형의 배지로 전환하려면 통과 후 최소 1일 후에 배지를 교체하십시오.

5. 패시징

참고: iPSC 콜로니가 충분히 커지거나(직경 > 2mm) 콜로니가 서로 접촉하려고 할 때 세포를 계대해야 합니다. 일반적으로 iPSC는 약 5일마다 분할할 수 있습니다. 일상적인 유지 관리에는 덩어리 계대 (5.1 단계)를 사용하고 정의 된 수의 세포가 필요한 실험에는 단일 세포 계대 (5.2 단계)를 사용합니다. iPSC가 많이 분화되는 경우 콜로니 피킹(5.3단계)이 배양의 순도를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다.

  1. 덩어리 패시징
    1. 웰 당 500 μL의 기저막 매트릭스를 첨가하여 기저막 매트릭스가 코팅된 12-웰 플레이트를 준비하고, 플레이트를 이동시켜 액체를 분배하였다. 플레이트를 37°C에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 기저막 매트릭스를 500 μL의 PSC 배양 배지로 교체하고 사용할 때까지 플레이트를 37°C에서 보관합니다.
    2. 배양된 세포로부터 배지를 흡인하고, 500 μL의 DPBS를 조심스럽게 첨가하여 세포를 세척한다. DPBS를 제거하고 500 μL의 0.5 mM EDTA를 웰에 첨가한다.
    3. 콜로니가 분리되기 시작할 때까지 RT에서 2-5분 동안 플레이트를 배양합니다. 현미경으로 세포를주의 깊게 관찰하십시오.
    4. 콜로니의 가장자리가 벗겨지기 시작하고 세포 사이의 틈이 보이기 시작하면(그림 3A) EDTA를 제거하고 DPBS 500μL를 조심스럽게 추가합니다.
      알림: 플레이트에서 셀이 분리되지 않도록 항상 웰의 측벽에 피펫을 대고 셀에 직접 대지 마십시오.
    5. DPBS를 흡인하고 p1000 피펫을 사용하여 500μL의 PSC 배양 배지로 웰을 플러시합니다. 콜로니를 적절한 크기의 덩어리로 분산시키기 위해 1x-5x 위아래로 피펫팅합니다(그림 3A). 피펫을 너무 많이 사용하지 마십시오.
      알림: iPSC가 실수로 너무 많이 피펫팅된 경우 10μM의 Rock 억제제 Y-27632를 배지에 추가합니다. 이것은 iPSC가 단일 세포로 생존할 수 없기 때문에 생존을 향상시킬 수 있습니다.
    6. 세포 덩어리 현탁액의 1/10-1/50을 새로운 웰로 옮깁니다. 비율은 분할 전 웰의 밀도, 시딩된 세포의 원하는 밀도 및 iPSC 클론 선호도에 따라 달라집니다.
    7. 접시를 앞뒤로 여러 번 부드럽게 움직여 덩어리를 우물에 고르게 분배하십시오. 덩어리가 부착되도록 37°C에서 최소 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
    8. 많은 부유 죽은 세포가 관찰되는 경우 배지를 750μL의 PSC 배양 배지로 교체하십시오. 그렇지 않으면 250 μL의 PSC 배양 배지를 추가합니다. 플레이트를 37°C 및 5%CO2 인큐베이터에 놓습니다.
      참고: 30분 후 배지 교체는 특히 불안정한 세포주(예: NHP)의 경우 매우 중요합니다.
    9. 식민지가 통과하기에 충분히 커질 때까지 2-3 일마다 배지를 교체하십시오. 중간 변경의 경우 프로토콜의 4단계를 수행합니다.
  2. 단일 셀 패시징
    1. PSC 배양 배지에 10 μM Y-27632를 첨가하여, 단계 5.1.1에 명시된 바와 같이 기저막 매트릭스-코팅된 배양 플레이트를 준비한다.
      선택 사항: 민감한 세포주의 생존을 향상시키기 위해 계대시간 1-3시간 전에 세포에 10μM Y-27632를 추가합니다.
    2. 배지를 흡인하고 500 μL의 DPBS를 첨가하여 세포를 세척한다. DPBS를 제거하고 300μL의 분리 용액을 웰에 추가합니다.
    3. 플레이트를 37°C에서 5-10분 동안 인큐베이션합니다. 현미경으로 세포의 충분한 박리가 관찰되면 700μL의 PSC 배양 배지 또는 DPBS를 추가합니다.
    4. 세포가 단일 세포로 해리될 때까지 p1000 피펫을 사용하여 5-10배 위아래로 피펫팅합니다. 세포 손상을 방지하기 위해 피펫을 너무 많이 사용하지 마십시오.
    5. 세포 현탁액을 최소 2mL의 DPBS가 들어 있는 15mL 튜브로 옮겨 분리 용액을 희석합니다.
    6. 튜브를 200× g 에서 5분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 용액을 완전히 흡인합니다.
    7. 10μM Y-27632가 보충된 PSC 배양 배지 500μL에 펠렛을 재현탁합니다.
    8. 세포 및 시드 5,000-7,000 세포를 단계 5.2.1에서 제조된 기저막 매트릭스-코팅된 12-웰 플레이트 당 계수한다.
      알림: 다른 셀 번호가 필요한 경우 그에 따라 더 크거나 작은 우물로 변경하십시오.
    9. 플레이트를 37°C 및 5%CO2 에서 적어도 30분 동안 인큐베이션하여 세포가 부착되게 한다.
    10. 많은 죽은 세포가 관찰되는 경우 배지를 750 μL의 PSC 배양 배지 + 10 μM Y-27632로 교체하십시오. 그렇지 않으면 250 μL + 10 μM Y-27632를 추가합니다.
      참고: 이 단계는 특히 불안정한 세포주(예: NHP)의 경우 매우 중요합니다.
    11. 플레이트를 37°C 및 5%CO2 인큐베이터에 놓습니다.
    12. 배지를 Y-27632 없이 배양한 후 1 내지 2일 후에 PSC 배양 배지로 변경하여, 세포가 고전적인 콜로니 형태를 다시 나타낼 수 있도록 하였다(도 3B).
    13. 식민지가 충분히 커질 때까지 2 일마다 배지를 교체하십시오. 중간 변경의 경우 프로토콜의 섹션 4를 따르십시오.
  3. 콜로니 피킹에 의한 iPSC의 통과
    1. 5.1.1 단계에 명시된 대로 기저막 매트릭스 코팅된 12-웰을 준비합니다.
    2. 배지를 흡인하고 500 μL의 DPBS를 조심스럽게 첨가하여 세포를 세척한다. DPBS를 제거하고 500 μL의 0.5 mM EDTA를 웰에 첨가한다.
    3. RT에서 플레이트를 1-3 분 동안 배양하고 콜로니의 분리가 경계에서 보일 때까지 현미경으로 세포를 관찰하십시오.
    4. EDTA를 제거하고 500 μL의 DPBS를 조심스럽게 첨가한다. 세포를 분리하지 않고 500μL의 PSC 배양 배지를 웰에 천천히 추가하기 전에 액체를 흡인합니다.
    5. p200 피펫을 사용하여 분화된 세포를 수집하지 않고 현미경으로 원하는 콜로니를 선택합니다. 이렇게하려면 세포가 들어있는 배지를 차지하면서 식민지를 부드럽게 긁습니다.
    6. 각각의 선택된 콜로니를 단계 5.3.1에서 제조된 바와 같이 하나의 기저막 매트릭스-코팅된 웰로 옮긴다. p1000 피펫을 사용하여 세포를 2-5배 피펫팅하여 세포를 작은 덩어리로 분리합니다.
    7. 플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 30분 동안 인큐베이션하여 덩어리가 부착되도록 합니다.
    8. 많은 부유 죽은 세포가 관찰되는 경우 배지를 750μL의 PSC 배양 배지로 교체하십시오. 그렇지 않으면 250 μL의 PSC 배양 배지를 추가합니다.
      참고: 30분 후 배지 교체는 특히 불안정한 세포주(예: NHP)의 경우 매우 중요합니다.
    9. 플레이트를 37°C 및 5%CO2 인큐베이터에 놓습니다.
    10. 식민지가 통과하기에 충분히 커질 때까지 2-3 일마다 배지를 교체하십시오. 이렇게 하려면 프로토콜의 섹션 4를 따릅니다.

6. 장기 보관을 위한 비뇨기 세포 및 iPSC의 동결

참고: 일반적으로 iPSC는 계수 없이 세포 동결 배지에서 덩어리로 동결됩니다. 단일 세포로의 해리를 피하기 위해 피펫팅을 최소화해야 합니다. 비뇨기 세포의 경우, 관당 1.5 ×10 4 내지 3 × 104 개의 세포가 동결되어, 사용자가 다른 계수 단계 없이 12웰 플레이트의 한 웰에서 직접 하나의 튜브를 해동할 수 있습니다.

  1. 15mL 튜브에 5mL의 DPBS를 준비합니다.
  2. 비뇨기 세포의 동결을 위해서는 프로토콜의 2.2-2.4 단계를 따르십시오. iPSC를 동결하려면 덩어리 통과 프로토콜의 5.1.2-5.1.5단계를 따르십시오.
  3. 현탁액을 단계 6.1에서 제조된 15 mL 튜브로 옮긴다. 비뇨기 세포의 동결을 위해, hemocytometer를 사용하여 세포 현탁액의 10 μL를 세십시오. 세포를 200 × g에서 5 분 동안 원심 분리하고 상청액을 완전히 흡인합니다.
  4. 튜브당 400μL의 세포 동결 배지에 세포 펠릿을 재현탁하고 원하는 양의 cryotube에 세포를 분배합니다.
  5. cryotube를 즉시 -80 °C로 옮깁니다. 장기간 보관을 위해 -80°C에서 냉동한 후 1일 후에 냉동된 튜브를 -150°C 냉동고 또는 액체 질소로 옮깁니다.

7. 비뇨기 세포 및 iPSC의 해동

  1. 비뇨기 세포의 해동을 위해, 프로토콜의 1.1 단계에 명시된 바와 같이, 원하는 양의 젤라틴-코팅된 12-웰을 준비한다. iPSC의 경우, 5.1.1 단계에 명시된 바와 같이 기저막 매트릭스 코팅된 12웰 플레이트를 준비한다. 두 경우 모두 매트릭스를 매체와 교환하지 마십시오.
  2. 4 mL의 DPBS가 들어있는 15 mL 튜브를 준비하고, 37 °C에서 보관한다.
  3. 떠 다니는 얼음 조각이 보일 때까지 해동을 위해 냉동 된 세포 바이알을 37 °C 수조에 빠르게 놓습니다.
    알림: 오염을 방지하기 위해 수조에서 배양하기 전후에 에탄올로 cryotube를 닦으십시오.
  4. 얼음 함유 현탁액에 비뇨기 세포용 REMC 배지 500μL 또는 iPSC용 PSC 배양 배지 500μL를 추가하고 즉시 현탁액을 단계 7.2에서 제조된 예열된 15mL 튜브로 옮깁니다.
  5. 튜브를 200 × g 에서 5 분 동안 원심 분리하고 상층액을 완전히 버립니다.
  6. 비뇨기 세포의 경우 펠릿을 1mL의 REMC 배지에 재현탁합니다. iPSC의 경우 펠렛을 750μL의 PSC 배양 배지에 조심스럽게 재현탁합니다. 덩어리를 온전하게 유지하기 위해 피펫팅을 너무 많이 하지 마십시오.
    선택 사항: 배지에 10μM Y-27632를 보충하면 해동 후 iPSC의 생존을 지원할 수 있습니다.
  7. 단계 7.1에서 제조된 12-웰 플레이트로부터 매트릭스를 흡인하고, 세포 현탁액을 웰로 조심스럽게 옮긴다.
  8. 플레이트를 37°C 및 5%CO2 인큐베이터에서 밤새 놓는다.
  9. 다음날 배지를 PSC 배양 배지로 교체하고 iPSC의 경우 Y-27632가 없고 비뇨기 세포의 경우 REMC로 교체합니다.
  10. 세포를 인큐베이터에서 37°C 및 5%CO2 에서 성장시킨다.
  11. 세포가 계대 배양을 위해 충분히 커질 때까지 2-3 일마다 배지를 교체하십시오. 중간 변경의 경우 프로토콜의 섹션 4를 따르십시오.

8. 면역세포화학

참고: NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 및 EpCAM과 같은 만능 관련 마커를 표적으로 하는 항체를 사용한 면역염색은 새로 생성된 iPSC에서 가장 널리 사용되는 검증 중 하나입니다. 항체 및 희석액에 대한 추가 정보는 물질 표에서 찾을 수 있습니다.

  1. 적절한 수의 12웰 플레이트에 사용하기 1-3일 전에 iPSC를 플레이트합니다. 배지를 흡인하고, 500 μL의 DPBS를 첨가하여 세포를 세척하고, DPBS를 제거한다. 웰당 400μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 추가하고 RT에서 15분 동안 세포를 고정합니다.
  2. 4% PFA를 제거하고, 세포를 DPBS로 3배 세척한다. 웰 당 400 μL의 블로킹 완충액을 첨가하고, 플레이트를 RT에서 30 분 동안 인큐베이션한다.
  3. 차단 완충액을 흡인하고 400μL의 항체 희석 완충액(ADB)에 희석된 항체를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
  4. 1차 항체를 함유하는 ADB를 제거하고, 세포를 DPBS로 3배 세척한다.
  5. DPBS를 흡인하고 웰당 ADB에 희석된 400μL의 2차 항체를 추가합니다. 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 플레이트를 배양하십시오.
  6. ADB를 제거하고 DPBS로 세포를 3배 세척합니다. 웰당 DPBS에 희석된 1μg/mL 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 추가하고 RT에서 3분 동안 배양합니다.
  7. DAPI 용액을 흡인하고 DPBS로 세포를 3배 세척합니다. 이미징을 위해 500μL의 DPBS를 추가합니다.

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결과

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인간 및 NHP 소변에서 세포를 분리할 때 분리 직후 다양한 유형의 세포를 식별할 수 있습니다. 편평 세포와 다양한 작은 원형 세포가 소변과 함께 배설됩니다. 여성의 소변은 남성의 소변보다 훨씬 더 많은 편평 세포를 함유하고 있습니다(그림 1B - 0일; 보충 그림 S1). 1차 소변 배지에서 5일 동안 배양한 후 첫 번째 부착성 증식 세포를 볼 수 있습니다(그림 1A, B - 5일). 이 시점에서, 배지의 절반은 첫 번째 콜로니가 나타날 때까지 매일 REMC 증식 배지로 대체된다. 대략 13일째에, 부착 세포는 계대배양될 수 있는 큰 콜로니로 성장한다(도 1B - 13일째). 이러한 콜로니는 형태학적으로 구별되는 두 가지 세포 유형으로 형성될 수 있는데, 하나는 세포가 밀접하게 부착되어 성장하는 상피와 유사한...

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토론

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iPSC는 시험관 내에서 접근할 수 없는 세포 유형을 생성할 수 있기 때문에 가치 있는 세포 유형입니다. 재프로그래밍을 위한 출발 물질로서, 예를 들어, 섬유아세포는 모든 영장류 종에서 쉽게 구할 수 있는 것은 아니지만, 이 논문은 소변 유래 세포에서 iPSC를 생성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 세포는 배양 배지에 광범위한 항생제를 보충하여 비멸균 영장류 소변 샘플에서도 비침습적 방식으로 얻을 수 있습니다.

프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 추가 논의가 필요합니다. 첫째, 비멸균 소변에서 세포를 분리할 때 오염 위험을 줄이기 위해 광범위한 항균 시약으로 배지를 보충하는 것이 중요합니다. 항생제 사용에도 불구하고 미생물 오염의 증가가 명백 해지면 전체 배양 물을 버리고 해당 지역을 소독하는 것이 좋습니다. 또한, 우리의 경험에 따르면, 지속적인 배양은 건강하게 성장하는 요 세포를 생성하지 않습니다. 둘째, 세포 재프로그래밍을 시작할 때 과잉 밀도로 인한 ...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 DFG EN 1093/5-1(프로젝트 번호 458247426)의 지원을 받았습니다. M.O.는 JSPS Overseas Research Fellowship의 지원을 받았습니다. 모든 피규어는 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 유세포 분석은 뮌헨 생물 의학 센터의 핵심 시설 유세포 분석의 도움으로 수행되었습니다. 비디오 촬영을 지원해 주신 교토 대학 ASHBi의 Makoto Shida와 Tomoyo Muto에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Accumax™ 세포 분리 솔루션 (Detachment solution)Sigma-AldrichSCR006
Amphotericin B-SolutionMerckA2941-100ML
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody Stem Cell Technologies60064희석: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE 결합 항체 Miltenyi Biotec130-122-965희석: 1/50
Bambanker™ (세포 동결 매체)Nippon GeneticsBB01
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-AldrichA3059-100G
세포 배양 멀티 웰 플레이트, 12 웰 CELLSTARGreiner BIO-ONE665180
Countess ™ II 자동 세포 계수기Thermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes)Sued-Laborbedarf52 95-0213다양한 유형의 극저온관을 동결에 사용할 수 있습니다. 2D 바코드 튜브는 샘플 정보를 고유한 튜브 정보와 함께 데이터베이스에 저장할 수 있다는 장점
사이토튠&트레이드; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)Thermo Fisher ScientificA16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)Thermo Fisher ScientificA16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochlorideSigma-Aldrich10236276001
DMEM High 포도당TH. GeyerL0102
DMEM/F12 w L-glutamineFisher Scientific15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) 고용량 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor™ 488Thermo Fisher ScientificA-21202희석: 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 고로 교차 흡착된 2차 항체, Alexa Fluor™ 594Thermo Fisher ScientificA-21207희석: 1/500
칼슘 없음 DPBS 마그네슘TH. GeyerL0615-500
EpCAM 재조합 Polyclonal Rabbit 항체 (22 HCLC)Thermo Fisher Scientific710524희석 : 1/500
에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)Carl RothCN06.3
Falcon Tube 15 mL 원뿔형 바닥Greiner BIO-ONE188271-N
Falcon Tube 50 mL 원뿔형 바닥Greiner BIO-ONE227261
태아 소 혈청, 인증, 열 비활성화, 브라질 (FBS)Thermo Fisher Scientific10500064
FlowJo V10.8.2FlowJo 
돼지 껍질에서 추출한 663441 젤라틴Sigma-AldrichG1890-1KG
Geltrex™ LDEV-Free, hESC 인증, 감소 성장 인자 기저막 매트릭스Thermo Fisher ScientificA1413301
GlutaMAX™ 보충제Thermo Fisher Scientific35050038
Heracell™ 240i CO2 인큐베이터Fisher Scientific16416639
Heraeus HeraSafe 안전 캐비닛Kendro51017905
Human EGF, 프리미엄 등급Miltenyi Biotec130-097-749
ImageJ FijiVersion 2.9.0
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140035
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mLNerbe Plus04-212-1000
현미경 Nikon eclipse TE2000-SNikonTE2000-S
Mouse anti-alpha-Fetoprotein 항체R& D SystemsMAB1368희석: 1/100
마우스 안티 알파-스무스 근육 액틴 항체R& D 시스템MAB1420희석: 1/100
마우스 안티 베타-III 튜불린 항체R& D 시스템MAB1195희석: 1/100
mTeSR™ 1STEMCELL Technolgies85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb 세포 신호 기술4903S희석: 1/400
Normocure™ (항균 시약)Invivogenant-noc
Oct-4 Rabbit 항체 세포 신호 전달 기술2750S희석 : 1/400
파라 포름 알데히드 (PFA)시그마 - 알드리치441244-1KG
페니실린 - 스트렙토 마이신 (10.000 U / ml) (PS)Thermo Fisher Scientific15140122페니실린-스트렙토 마이신 혼합물은 100 U / mL 페니실린과 100 µ를 포함합니다. g/mL 스트렙토마이신.
재조합 인간 FGF-basicPeproTech100-18B
재조합 인간 PDGF-ABPeproTech100-00AB
냉장 벤치탑 원심분리기SIGMA 4-16KS
신장 상피 세포 기초 매체ATCCPCS-400-030
신장 상피 세포 성장 키트ATCCPCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) 마우스 mAb #4900세포 신호 기술4900S희석: 1/400
SSEA4 (MC813) 마우스 mAbNEB4755S희석: 1/500
StemFit® Basic02Nippon Genetics3821.00이 배지의 생산은 중단되었으며, 인간 세포주에는 StemFit Basic04CT를 사용하거나 인간이 아닌 영장류에는 StemFit Basic03을 사용하십시오.
트리톤 X-100 시그마-알드리치T8787-50ML
TrypLE™ 효소 선택 (1x), 페놀 레드 없음 (Dissociation enzyme)Thermo Fisher Scientific12563011
Waterbath Precision GP 05Thermo Fisher ScientificTSGP05
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor)BiozolBYT-ORB153635
항체 희석 완충액조성은 보충 자료를 참조하십시오. 표 S1
차단 완충액조성에 대해서는 보충 표 S1을 참조하십시오:
REMC 매체조성에 대해서는 보충 표 S1을 참조하십시오
: 1차 소변 매체조성에 대해서는 보충 표 S1을 참조하십시오
PSC 배양 배지조성에 대해서는 보충 표 S1
PSC 생성 배지구성에 대해서는 보충 표 S1을 참조하십시오
변 세척 완충액대해서는 보충 표 S1을 참조하십시오
이 있습니다.: , , . , , 를 참조하십시오.. 소에 .

참고문헌

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