본 프로토콜은 인간 및 비인간 영장류 소변 유래 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 분리, 확장 및 재프로그래밍하는 방법과 새로 생성된 iPSC의 피더 없는 유지 관리에 대한 지침을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
영장류 만능 줄기 세포와 그 유도체를 연구하는 종 간 접근법은 질병, 발달 및 진화의 분자 및 세포 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 영장류 유도만능줄기세포(iPSC)에 보다 쉽게 접근할 수 있도록 하기 위해 본 논문에서는 소변 유래 세포에서 인간 및 비인간 영장류 iPSC를 생성하는 비침습적 방법과 피더 프리 배양 방법을 사용한 유지 관리를 제시합니다.
소변은 비멸균 환경(예: 동물의 케이지)에서 샘플링하고 1차 세포 배양 중에 광범위한 항생제 칵테일로 처리하여 오염을 효율적으로 줄일 수 있습니다. 소변 유래 세포의 증식 후, iPSC는 상업적으로 이용 가능한 센다이 바이러스 벡터 시스템의 변형된 형질도입 방법에 의해 생성됩니다. 첫 번째 iPSC 콜로니는 이미 5일 후에 볼 수 있으며 빠르면 10일 후에 채취할 수 있습니다. 효소가 없는 해리 완충액을 사용한 일상적인 덩어리 계대배양은 50개 이상의 계대에 대해 생성된 iPSC의 다능성을 지원합니다.
서론
인간과 비인간 영장류(NHP)의 게놈 비교는 우리의 진화 역사와 인간 특이적 형질의 진화를 이해하는 데 중요합니다1. 추가적으로, 이러한 비교는 보존된 DNA 서열2을 식별함으로써, 예를 들어, 질병 관련 변이체3의 우선순위를 정함으로써 기능의 추론을 가능하게한다. 유전자 발현 수준과 같은 분자 표현형의 비교는 게놈 비교를 더 잘 해석하고 예를 들어 세포 표현형 차이를 발견하는 데 중요합니다. 또한, DNA 수준에서의 비교와 유사하게 기능적 관련성을 추론할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 따라서 인간 내에서 의학적으로 관련된 변이를 더 잘 해석할 수 있다4. 이러한 비교 연구에 포괄적인 분자 표현형 데이터를 통합하려면 적절한 생물학적 자원(즉, 종 전반에 걸친 상동 세포)이 필요합니다. 그러나 윤리적이고 실용적인 이유로 인해 특히 개발 중에 이러한 유사한 세포에 접근하는 것이 어렵거나 불가능합니다. 유도만능줄기세포(iPSCs)는 시험관 내에서 접근하기 어려운 세포 유형의 생성을 가능하게 하고5,6, 실험적으로 접근가능하며, 영장류 비교에 사용되어 왔다
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프로토콜
이 실험 절차는 인간 실험에 대한 책임 윤리 위원회(20-122, Ethikkommission LMU München)의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다.
참고: 인간 및 NHP 샘플을 다루는 실험을 시작하기 전에 적절한 윤리 위원회의 승인을 받아야 합니다. 모든 실험 절차는 관련 지침 및 규정에 따라 수행되어야 합니다. 다음 각 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 수행해야 합니다. 모든 완충액 및 배지 조성은 보충표 S1에서 찾을 수 있다. 셀에 첨가하기 전에 모든 배지를 실온(22°C)으로 예열해야 합니다. 각 원심분리 단계는 달리 언급되지 않는 한 실온에서 수행되어야 한다.
1. 소변 샘플에서 세포 분리
주의: 인간 기증자가 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스(HBV) 및 C형 간염 바이러스(HCV)가 없는지 확인하십시오. NHP의 경우 가능한 기증자/세포에 특정 병원체인 B 바이러스(BV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 유인원 베타레트로바이러스(SRV) 및 유인원 T 세포 림프친화성 바이러스(STLV)가 없는지 확인하십시오.
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결과
인간 및 NHP 소변에서 세포를 분리할 때 분리 직후 다양한 유형의 세포를 식별할 수 있습니다. 편평 세포와 다양한 작은 원형 세포가 소변과 함께 배설됩니다. 여성의 소변은 남성의 소변보다 훨씬 더 많은 편평 세포를 함유하고 있습니다(그림 1B - 0일; 보충 그림 S1). 1차 소변 배지에서 5일 동안 배양한 후 첫 번째 부착성 증식 세포를 볼 수 있습니다(그림 1A, B - 5일). 이 시점에서, 배지의 절반은 첫 번째 콜로니가 나타날 때까지 매일 REMC 증식 배지로 대체된다. 대략 13일째에, 부착 세포는 계대배양될 수 있는 큰 콜로니로 성장한다(도 1B - 13일째). 이러한 콜로니는 형태학적으로 구별되는 두 가지 세포 유형으로 형성될 수 있는데, 하나는 세포가 밀접하게 부착되어 성장하는 상피와 유사한.......
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토론
iPSC는 시험관 내에서 접근할 수 없는 세포 유형을 생성할 수 있기 때문에 가치 있는 세포 유형입니다. 재프로그래밍을 위한 출발 물질로서, 예를 들어, 섬유아세포는 모든 영장류 종에서 쉽게 구할 수 있는 것은 아니지만, 이 논문은 소변 유래 세포에서 iPSC를 생성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 세포는 배양 배지에 광범위한 항생제를 보충하여 비멸균 영장류 소변 샘플에서도 비침습적 방식으로 얻을 수 있습니다.
프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 추가 논의가 필요합니다. 첫째, 비멸균 소변에서 세포를 분리할 때 오염 위험을 줄이기 위해 광범위한 항균 시약으로 배지를 보충하는 것이 중요합니다. 항생제 사용에도 불구하고 미생물 오염의 증가가 명백 해지면 전체 배양 물을 버리고 해당 지역을 소독하는 것이 좋습니다. 또한, 우리의 경험에 따르면, 지속적인 배양은 건강하게 성장하는 요 세포를 생성하지 않습니다. 둘째, 세포 재프로그래밍을 시작할 때 과잉 밀도로 인한 .......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 DFG EN 1093/5-1(프로젝트 번호 458247426)의 지원을 받았습니다. M.O.는 JSPS Overseas Research Fellowship의 지원을 받았습니다. 모든 피규어는 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 유세포 분석은 뮌헨 생물 의학 센터의 핵심 시설 유세포 분석의 도움으로 수행되었습니다. 비디오 촬영을 지원해 주신 교토 대학 ASHBi의 Makoto Shida와 Tomoyo Muto에게 감사드립니다.
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재료
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| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | 희석: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE 결합 항체 | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | 희석: 1/50 |
| Bambanker™ (세포 동결 매체) | Nippon Genetics | BB01 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| 세포 배양 멀티 웰 플레이트, 12 웰 CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess ™ II 자동 세포 계수기 | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | 다양한 유형의 극저온관을 동결에 사용할 수 있습니다. 2D 바코드 튜브는 샘플 정보를 고유한 튜브 정보와 함께 데이터베이스에 저장할 수 있다는 장점 |
| 사이토튠&트레이드; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
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| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) 고용량 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | 희석: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 고로 교차 흡착된 2차 항체, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | 희석: 1/500 |
| 칼슘 없음 DPBS 마그네슘 | TH. Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM 재조합 Polyclonal Rabbit 항체 (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | 희석 : 1/500 |
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| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | 이 배지의 생산은 중단되었으며, 인간 세포주에는 StemFit Basic04CT를 사용하거나 인간이 아닌 영장류에는 StemFit Basic03을 사용하십시오. |
| 트리톤 X-100 | 시그마-알드리치 | T8787-50ML | |
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| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
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| 차단 완충액 | 조성에 대해서는 보충 표 S1을 참조하십시오: | ||
| REMC 매체 | 조성에 대해서는 보충 표 S1을 참조하십시오 | ||
| : 1차 소변 매체 | 조성에 대해서는 보충 표 S1을 참조하십시오 | ||
| PSC 배양 배지 | 조성에 대해서는 보충 표 S1 | ||
| PSC 생성 배지 | 구성에 대해서는 보충 표 S1을 참조하십시오 | ||
| 변 세척 완충액 | 대해서는 보충 표 S1을 참조하십시오 |
참고문헌
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al.
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