본 프로토콜은 교모세포종 세포에 대한 미세아교세포의 항종양 특성을 향상시키는 잠재적인 면역 조절 분자로서 4가지 다른 진균 β글루칸의 정제 단계 및 후속 연구를 설명합니다.
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방법 논문
교모세포종에 대한 면역요법 전략으로서의 진균성 β-글루칸의 분리 및 정제
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
교모세포종에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 데 있어 가장 큰 과제 중 하나는 종양 미세 환경 내에서 강력한 면역 억제를 극복하는 것입니다. 면역 요법은 종양 세포에 대한 면역계 반응을 돌리는 효과적인 전략으로 부상했습니다. 신경아교종 관련 대식세포 및 미세아교세포(GAM)는 이러한 항염증 시나리오의 주요 동인입니다. 따라서 GAM에서 항암 반응을 향상시키는 것은 교모세포종 환자를 치료하기 위한 잠재적인 공동 보조 요법을 나타낼 수 있습니다. 그런 맥락에서 곰팡이 β글루칸 분자는 오랫동안 강력한 면역 조절제로 알려져 왔습니다. 선천성 면역 활동을 자극하고 치료 반응을 개선하는 능력이 설명되었습니다. 이러한 조절 기능은 부분적으로 패턴 인식 수용체에 결합하는 능력에 기인하며, 흥미롭게도 GAM에서 크게 표현됩니다. 따라서 이 작업은 교모세포종 세포에 대한 미세아교세포의 종양 반응을 향상시키기 위한 진균 β글루칸의 분리, 정제 및 후속 사용에 중점을 둡니다. 마우스 교모세포종(GL261) 및 미세아교세포(BV-2) 세포주는 현재 바이오 제약 산업에서 많이 사용되는 버섯에서 추출한 4가지 다른 진균 β글루칸(Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus 및 Ganoderma lucidum)의 면역 조절 특성을 테스트하는 데 사용됩니다. 이들 화합물을 시험하기 위해, 교모세포종 세포에서의 증식 및 세포자멸사 활성화에 대한 사전 활성화된 미세아교세포-조건화 배지의 효과를 측정하기 위해 공동-자극 분석을 수행하였다.
서론
신경 종양학 분야에서 새로운 업적이 출현 했음에도 불구하고 교 모세포종 환자의 기대 수명은 여전히 미미합니다. 뇌종양에 대한 표준 치료법은 수술, 방사선 요법 및 화학 요법의 융합을 기반으로 합니다. 그러나 지난 10년 동안 면역요법은 다양한 유형의 암을 치료하기 위한 강력한 전략으로 부상했다1. 따라서 종양 세포에 대한 신체의 면역 반응을 활용할 수 있는 가능성은 최근 종양학의 네 번째 기둥이 되었습니다.
이 분야에서 가장 큰 과제 중 하나는 종양미세환경2에서 발견되는 강력한 면역억제를 극복하는 것으로 오랫동안 알려져 왔다. 특히, 가장 흔하고 공격적인 형태의 뇌암 중 하나인 교모세포종의 경우, 이러한 종양 전(前)종양 시나리오를 조율하는 주요 경로를 밝히고 면역 체계의 우울한 반응을 상쇄할 수 있는 새로운 화합물을 찾는 것은 이 난치병에 대한 미래 치료법의 길을 열 수 있습니다.
뇌는 자체 면역 체계 세포를 가지고 있으며 가장 관련성이 높은 세포 유형은 미세 아교 세포입니다. 이 세포들은 서로 다른 중추 질환에 걸쳐 다소 복잡한 행동을 하는 것으로 입증되었다3. ....
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프로토콜
이 프로토콜에 설명된 4가지 다른 버섯 변종은 상업적 출처에서 얻은 것입니다( 재료 표 참조).
1. 곰팡이 β글루칸의 분리
- 용해성 버섯 다당류의 추출 및 분리
참고: 가용성 버섯 다당류(SMP)는 그림 1에 개략적으로 표시된 절차에 따라 얻었습니다.- 신선한 P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus 및 G. lucidum 자실체(약 2,000g/버섯)를 증류수로 5회 부드럽게 헹굽니다.
- 자실체를 50 ± 2 °C에서 일정한 무게에 도달 할 때까지 기존의 공기 건조 오븐에서 건조시킵니다 (~ 24 시간).
- 말린 버섯을 블레이드 밀에 갈아서 각 버섯에서 약 200g의 분말을 얻습니다.
- 100g의 버섯 분말(MP)(P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus 및 G. lucidum)을 1,000mL의H2Od에 현탁합니다. 이어서....
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결과
β글루칸의 성공적인 정제
추출 및 정제 과정을 거쳐 P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum 및 H. erinaceus 의 자실체에서 얻은 MP, SMP 및 SβG의 질량은 표 1에 요약되어 있습니다. 진균으로부터 얻어진 MP, SMPs 및 SβGs의 기본 조성(총 탄수화물, β-글루칸 및 단백질)은 표 2에 묘사되어 있다. 이러한 결과는 프로토콜이 어떻게 SMP에서 많은 양의 단백질 함량을 검색할 수 있었는지 보여줍니다. 그러나 α-아밀라아제/글루코아밀라아제 및 프로테아제를 사용한 효소 처리는 단백질의 양을 감소시키고 β-글루칸 농도를 증가시켰습니다.
상이한 SβG의 UV 스펙트럼은 260 및 280 nm에서 UV 흡수 피크를 나타내지 않았으며(그림 2A
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토론
이 연구는 4가지 다른 균류에서 SβG의 함량을 성공적으로 분리, 정제 및 특성화하기 위해 잘 확립된 기술의 사용을 설명합니다. 그 결과, P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum, H. erinaceus로부터 얻은 SMP를 열수 추출한 후 α-아밀라아제, 글루코시다아제, 프로테아제로 가수분해 처리한 후 α-글루칸과 단백질의 함량이 감소하여 순수한 SβG의 양이 크게 풍부해졌습니다.
그럼에도 불구하고 우리는 대부분의 곰팡이 β글루칸이 정제 과정에서 수불용성임을 관찰했습니다. 이 연구의 주요 관심사는 SβGs의 의학적/약학적 특성10,18로 인해 SβG였습니다. 또한, 가수분해 처리, 에탄올 침전 및 투석 덕분에 수용성 저분자량 탄수화물, 펩타이드, 올리고펩타이드 및 아미노산이 SMP에서 성.......
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공개 사항
선언 할 경쟁 이익이 없습니다.
감사의 글
ImageJ에서 fuluorescence 신호를 측정하기 위한 사내 스크립트를 제공한 Vasiliki Economopoulos 박사에게 감사드립니다. 또한 시위 기간 동안 지원해 주신 CITIUS(세비야 대학교)와 모든 직원들에게도 감사드립니다. 이 작업은 스페인 FEDER I + D + i-USE의 지원을 받았으며 세비야 대학의 US-1264152 및 Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 8웰 챔버 슬라이드 | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | 프로테아제 | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, 미국 | A32728 | |
| 블레이드 밀 | Retsch, 독일 | SM100 | |
| 소 혈청 알부민 | MERK, 독일 | A9418 | |
| 셀룰로오스 튜빙 멤브레인 | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| 원심분리기 | MERK, 독일 | Eppendorf, 5810R | |
| 공동 현지화 플러그인 | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, 독일 | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, 덴마크 | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´ s 수정된 Eagle´ s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| 그래프 작성 및 분석 소프트웨어 | GraphPad 프리즘(GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4<> | |||
| HPLC 시스템 | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| 인큐베이터 | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| 질량분석기 | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| 파라포름알데히드 | MERK, 독일 | P6148 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered | saline Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) 항체 | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 단클론 | 써모피셔, 미국 | MA5-14520 | |
| 회전 증발기 | Bü 치 이브&이큐트; rica S.L.U., 스페인 | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO 컨포칼 현미경 시스템. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | 버섯 4종 공급 |
참고문헌
- Aldape, K., et al. Challenges to curing primary brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).
- Himes, B. T., et al. Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications. Fr....
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재인쇄 및 허가
