Method Article

연령 관련 황반변성의 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 평가하고 정량화하기 위한 프로토콜

DOI:

10.3791/64927

⸱

March 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마우스 모델은 망막 색소 상피(RPE)의 생물학을 조사하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 마우스가 일련의 RPE 병리를 개발할 수 있다는 것이 확인되었습니다. 여기에서는 빛, 투과 전자 및 공초점 현미경을 사용하여 마우스의 RPE 병리를 설명하고 정량화하는 표현형 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

연령 관련 황반변성(AMD)은 고령화 인구에서 쇠약하게 만드는 망막 장애입니다. 망막 색소 상피(RPE)의 기능 장애는 AMD의 주요 병리학적 사건으로 널리 알려져 있습니다. RPE 기능 장애로 이어지는 메커니즘을 이해하기 위해 연구자들은 마우스 모델을 활용할 수 있습니다. 이전 연구에 의해 마우스가 RPE 병리를 일으킬 수 있다는 것이 확인되었으며, 그 중 일부는 AMD 진단을 받은 개인의 눈에서 관찰됩니다. 여기에서는 마우스의 RPE 병리를 평가하기 위한 표현형 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 광학 현미경 및 투과 전자 현미경을 사용한 망막 단면의 준비 및 평가와 컨포칼 현미경에 의한 RPE 플랫 마운트의 준비 및 평가가 포함됩니다. 우리는 이러한 기술에 의해 관찰되는 쥐 RPE 병리의 일반적인 유형과 통계적 테스트를 위한 편견 없는 방법을 통해 이를 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 개념 증명으로 이 RPE 표현형 프로토콜을 사용하여 막횡단 단백질 135(Tmem135)를 과발현하는 마우스와 노화된 야생형 C57BL/6J 마우스에서 관찰된 RPE 병리를 정량화합니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 AMD의 마우스 모델을 사용하는 과학자들을 위한 편견 없는 정량적 평가와 함께 표준 RPE 표현형 방법을 제시하는 것입니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

연령 관련 황반변성(AMD)은 55세 이상의 인구에게 영향을 미치는 흔한 실명 질환입니다1. 많은 연구자들은 망막 색소 상피(RPE) 내의 기능 장애가 AMD2의 초기이자 중요한 병리생물학적 사건이라고 믿습니다. RPE는 인접한 광수용체와 맥락막 혈관의 항상성을 유지하는 역할을 하는 분극 세포의 단층이다3. 세포 배양 모델 4,5 및 마우스 6,7,8을 포함하여 RPE 내에서 질병 관련 메커니즘을 조사하기 위한 다양한 모델이 존재합니다. 최근 보고서에서는 RPE 세포 배양 모델4에 대한 표준화된 프로토콜과 품질 관리 기준을 설명했지만, 마우스 모델에서 RPE의 표현형을 표준화하려는 시도는 없었다. 사실, AMD의 마우스 모델에 대한 많은 출판물에는 RPE에 대한 완전한 설명이나 RPE 병리의 정량화가 부족합니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 AMD 마우....

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Protocol

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동물 피험자와 관련된 모든 절차는 위스콘신-매디슨 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) 성명서를 준수합니다.

1. 광학 현미경에 의한 마우스 RPE 평가

  1. 유리병에 실온(RT)에서 최종 농도가 2%인 파라포름알데히드와 2%의 글루타르알데히드를 갖는 고정액 완충액을 만듭니다.
    참고: 이 프로토콜에는 마우스당 최대 14mL의 고정 완충액이 필요합니다.
    주의 : 파라포름알데히드와 글루타르알데히드는 유해 물질입니다. 이러한 물질로 작업할 때는 표준 작동 절차를 따르십시오.
  2. 흄 후드의 심장 관류를 위한 흡수성 언더패드에 중력 공급 관류 시스템을 준비합니다(보충 그림 1A).
    1. 고정 완충액 40mL를 관류 시스템의 주사기 배럴에 넣습니다(보충 그림 1B).
    2. 버퍼가 튜빙 라인을 통해 흐를 수 있도록 튜빙 라인과 평행이 될 때까지 밸브를 돌립니다(보충 그림 1C). 라인에서 모든 기포가 제거될 때까....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사에 설명된 RPE 표현형 프로토콜의 완성은 AMD의 마우스 모델에서 일반적으로 관찰되는 구조적 RPE 이상에 대한 정량적 분석을 제공합니다. 이 프로토콜의 효과를 확인하기 위해 우리는 닭 베타-액틴 프로모터(Tmem135 TG)30 및 노화된 C57BL/6J 마우스31,32에 의해 구동되는 WT Tmem135를 과발현하는 형질전환 마우스를 포함하여 RPE 병리를 나타내는 것으로 알려진 마우스에 사용했습니다. 이 실험의 목적은 마우스 모델을 처음 접하는 연구자에게 이 프로토콜에 설명된 방법을 사용하여 얻을 수 있는 대표적인 결과를 보여주는 것입니다.

우리는 광학 현미경을 사용하여 RPE 병리를 평가하기 위해 WT 및 Tmem135 TG 마우스의 눈을 처리하고 평가하기 위해 프로토콜.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사에서는 마우스 모델의 구조적 RPE 병리를 평가하기 위한 표현형 프로토콜을 소개했습니다. 우리는 빛, 투과 전자 및 컨포칼 현미경을 포함한 다양한 이미징 기술을 위해 눈을 처리하는 데 필요한 단계와 이러한 이미징 방법을 통해 관찰되는 일반적인 병리의 정량화에 대해 설명했습니다. 우리는 Tmem135 TG 및 24개월 된 WT 마우스를 검사하여 RPE 표현형 프로토콜의 효과를 입증했는데, 이 마우스는 RPE 병리30,31,32를 나타내기 때문입니다. 이 프로토콜은 BLamD6,7뿐만 아니라 RPE 얇아짐, 공포화, 이동 및 이형성과 같은 RPE 병리를 가질 수 있는 유전자 변형 또는 약리학적으로 처리된 모든 마우스에 적용할.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜의 작성자는 공개 및 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 광학 현미경 검사를 위해 조직을 준비한 Satoshi Kinoshita와 University of Wisconsin(UW) Translational Research Initiatives in Pathology laboratory(TRIP)에 감사드립니다. 이 핵심은 UW 병리학 및 진단검사의학과, 위스콘신 대학교 카본 암 센터(P30 CA014520) 및 NIH 국장실(S10OD023526)의 지원을 받습니다. 컨포칼 현미경은 UW Department of Biochemistry Endowment의 지원으로 설립된 UW Biochemistry Optical Core에서 수행되었습니다. 이 작업은 또한 국립 안과 연구소 (R01EY022086 to A. Ikeda; R01EY031748에서 C. Bowes Rickman에게; P30EY016665 UW의 안과 및 시각 과학과에; P30EY005722 듀크 아이 센터로; NIH T32EY027721에서 M. Landowski에게; F32EY032766 to M. Landowski), Timothy William Trout 회장직 (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); 실명 예방 연구(Duke Eye Center)의 무제한 보조금.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 M 카코딜레이트 완충액 pH7.2PolyScientiifc R& D CompanyS1619
100 용량 슬라이드 박스이 프로토콜에는 두 개가 필요합니다(하나는 H& E-스테인드 슬라이드와 RPE 플랫 마운트용 슬라이드)
100% 에탄올 MDS Warehouse2292-CASE는 이 프로토콜에서 희석된 에탄올 용액을 만드는 데 사용할 수 있습니다.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer LocksQosina11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS)이 프로토콜에서는 사전 제작된 1x PBS를 사용할 수 있습니다.
2.0mL 마이크로튜브Genesee Scientific 24-283-LR
24 캐비티 임베딩 캡슐 대체 금형전자 현미경 과학70165
24인치 PVC 튜브(루어 엔드 포함) Fisher ScientificNC1376778
400 메쉬 길더 얇은 막대 사각 메쉬 그리드전자 현미경 과학T400-Cu
95% 에탄올MDS 창고2293-CASE
방수 수분 장벽이 있는 흡수성 언더패드 (23 인치 by 24 인치)VWR56616-031
조절 가능한 237 ml  스프레이 병VWR23609-182
Alexa Fluor488 복합 당나귀 안티-래빗 IgG Thermo Fisher ScientificA-21206
알루미늄 호일
BD 정밀 글라이드 19 게이지 주사기 바늘Sigma-Aldrich 
고사리 집게; 곡선; 미세한 십자가 톱니; 4" 길이, 1mm 팁 너비Roboz 수술 기구RS-5211이 프로토콜에서는 곡선 겸자로 알려져 있습니다.
낙타 털 브러시전자 현미경 과학65575-02
이산화탄소 안락사 챔버
이산화탄소 유량계
산화탄소 탱크
Castaloy 프롱 확장 클램프Fisher Scientific 05-769-7Q
주철 L자형 베이스 지지 스탠드Fisher Scientific 11-474-207
세포 증식 프로그램다운로드 가능: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail PolishElectron Microscopy Sciences72180
Colorfrost Microscope Slides LavenderVWR10118-956
Computer
DAPISigma-AldrichD9542-5MG
이 프로토콜에는 Milli-Q 정제 시스템의증류된 H20
Dumont 얇은 팁 핀셋; 패턴 #55Roboz 수술 기구RS-4984이 프로토콜에서는 끝이 가는 집게로 알려져 있으며 이 프로토콜에는 3개가 필요합니다(해부용 2개, 전자 현미경 처리용 1개).
전자 현미경 그리드 홀더전자 현미경 과학71147-01
EPON 815 수지전자 현미경 과학14910
Epredia Mark-It 조직 마킹 옐로우 염료Fisher Scientific 22050460이 조직 표시 염료를 사용할 때는 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. 
Epredia 마운팅 미디어Fisher Scientific22-110-610H 장착에 사용 & E 슬라이드. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series, 150 w 할로겐 광원Dolan-Jenner IndustriesMi-150현미경 해부용 광원.
Fiji ImageJ 프로그램다운로드 가능: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook ConnectorThermo Scientific   14-666-18Q
인산염 완충액의 흄 후드
JEM-1400 투과 전자 현미경(JEOL) ORIUS(1000) CCD 카메라
이 실험에는 두 가지가 필요합니다. 하나는 실온에 있어야 하고 다른 하나는 섭씨 4도의 냉장실에 있어야 합니다.
레이저 극저온 태그 라벨전자 현미경 과학77564-05
리드 시트레이트전자 현미경 과학17800
라이카 EM UC7초박 라이
카 라이커트 울트라컷 S 마이크로톰
리프터슬립스써모 피셔 사이언티픽22X22I24788001LSRPE 플랫 마운트에는 가장자리가 돌출되어 있고 RPE의 두께를 수용할 수 있으므로 이 커버슬립을 사용하십시오.
Mayer's HematoxylinVWR100504-406
McPherson-Vannas 마이크로 해부 스프링 가위Roboz 수술 기구RS-5600프로토콜에서 마이크로 해부 가위로 알려져 있습니다. 
메탄올피셔 사이언티픽 A412-4
마우스모든 AMD 마우스 모델 및 해당 컨트롤이 이 프로토콜에 대해 작동할 수 있습니다.
마이크로 해부 가위; 표준 버전; 곡선; 날카로운 점; 24mm 블레이드 길이; 4.5" 전체 길이Roboz 수술 기구RS-5913이 프로토콜에서는 곡선 가위로 알려져 있습니다.
Microsoft Excel
마이크로튜브 랙
Nikon A1RS 컨포칼 현미경
일반 당나귀 혈청SouthernBiotech0030-01
Number 11 멸균 일회용 메스 블레이드VWR21909-380
오스뮴 테트록사이드 전자 현미경 과학19150
파라포름알데히드, 32%전자 현미경 과학15714-S
연필
페트리 접시VWR 21909-380
피펫 팁
피펫 
Polyclonal Anti-ZO-1 항체Thermo Fisher Scientific402200
프로필렌 옥사이드전자 현미경 과학20412
면도날VWR10040-386
마우스 관류
Shandon Eosin Y AlcoholicVWR89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent MarkerStaples642736
StainingGrainger49WF31
스퀘어 커버 유리 슬립Fisher Scientific 12-541B
커버Grainger49WF30H 용 15 필요& E 염색 절차.
타겟 올 플라스틱 일회용 루어슬립 50 mL 주사기 써모 사이언티픽 S7510-50주사기 배럴만 사용하십시오.
타이머Fisher1464917
Uranyl Acetate전자 현미경 과학22400
진공 오븐
Vectashield 장착 MediumVector LaboratoriesH-1000RPE 플랫 마운트 장착에 사용합니다.
자일렌피셔 사이언티픽 
Zeiss Axio Imager 2 광학 현미경이 현미경은 스티칭된 20x 이미지를 생성할 수 있습니다. 광학 현미경이 이러한 용량을 가지고 있지 않으면 서로 약간 겹치는 전체 망막의 이미지를 촬영하십시오. Adobe Photoshop을 사용하여 이러한 이미지를 함께 연결합니다. 이미지 스티칭에 대해서는 Adobe Photoshop 프로그램의 설명서를 참조하십시오. 
Zeiss Stemi 2000 해부 현미경전자 현미경 과학65575-02
Z192546 이 물이 사용되었습니다. 글루타르알데히드 2.5%, pH 7.4, 32% 전자 현미경 과학 16537-05 실험실 벤치탑 셰이커 포함 : 용 얕은 트레이용 슬라이드 랙 얼룩 접시 22050283

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G.

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