방법 논문

심장 부정맥의 복잡한 메커니즘을 조사하기 위한 혁신적인 툴킷

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DOI:

10.3791/64932

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2023년 2월 10일

1Department of Medicine I, University Hospital Munich (LMU), Ludwig-Maximilians-University Munich (LMU), 2Institute of Surgical Research at the Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, University Hospital, LMU Munich, 3DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA), 4Interfaculty Center for Endocrine and Cardiovascular Disease Network Modelling and Clinical Transfer (ICONLMU), LMU Munich

이 논문에서

초록

논의 된 기사 :

Tomsits, P., Schuttler, D., Kaab, S., Clauss, S., Voigt, N. Ca2+ 과도 전류 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (165), 10.3791/61964 (2020).

Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단일 세포 광학 활동 전위 측정. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (166), 10.3791/61890 (2020).

Xia, R. et al. 쥐 동방 및 방실 결절에서 상주 심장 대식 세포의 격리 및 배양. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (171), 10.3791/62236 (2021).

Xia, R. et al. 마우스의 동방 및 방실 노드의 전체 마운트 면역 형광 염색, 컨포칼 이미징 및 3D 재구성. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (166), 10.3791/62058 (2020).

Kumar, P., Si, M., Paulhus, K., Glasscock, E. 마우스의 내재적 심장 박동 결손을 식별하기 위한 동방 결절 발사 속도의 미세 전극 어레이 기록. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (173), 10.3791/62735 (2021).

Scherschel, K. et al. 쥐 성상 신경절의 위치, 해부 및 분석. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (166), 10.3791/62026 (2020).

Shimura, D., Hunter, J., Katsumata, M., Shaw, R. M. 전장 단백질의 발현을 유지하면서 mRNA에서 내부 번역 시작 부위를 제거합니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (181), 10.3791/63405 (2022년).

Rotzer, RD et al. 의식이 있는 마우스에서 자발적 압력 반사 민감도를 결정하기 위해 결합된 원격 측정 ECG 및 혈압 송신기의 이식. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (168), 10.3791/62101 (2021).

Tomsits, P. et al. 마우스의 부정맥을 감지하기 위해 장기 심전도 기록을 분석합니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (171), 10.3791/62386 (2021).

Grab, M. et al. 중재적 계획 및 훈련을 위한 3D 프린팅 심혈관 팬텀의 개발 및 평가. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (167), 10.3791/62063 (2021).

사설

부정맥은 매우 흔하고 임상적으로 관련성이 높습니다. 그러나 대부분의 치료 전략이 부정맥의 원인 메커니즘을 표적으로 삼기보다는 증상에만 초점을 맞추고 있기 때문에 현재의 치료는 대체로 불충분합니다. 따라서 새롭고 혁신적이며 인과적인 치료법을 개발하기 위해서는 복잡한 질병 메커니즘에 대한 더 나은 이해가 시급히 필요합니다.

현재 JoVE 방법 컬렉션의 목표는 부정맥 발생의 다양한 측면을 포괄적으로 조사할 수 있는 편견 없고 다양한 프로토콜 세트를 제공하는 것입니다.

변경된 칼슘 항상성은 부정맥 발생의 특징 중 하나이지만 여러 측면을 고려해야 하고 각각 연구하기 위해 특정 기술이 필요하기 때문에 조사하기가 여전히 어렵습니다 1,2. 이 방법 모음에서 Tomsits et al. 동일한 마우스에서 심방 및 심실 심근 세포를 분리하고 L형 칼슘 전류와 칼슘 과도 현상을 동시에 연구할 수 있는 프로토콜을 제공합니다3. 따라서 이 프로토콜을 통해 연구자들은 칼슘 교란을 보다 전 세계적으로 조사하고 동시에 동물 수를 줄일 수 있으며 이는 상당한 과학적, 윤리적 개선을 나타냅니다.

그럼에도 불구하고 분리된 세포를 패치하는 것은 여전히 복잡하고 노동 집약적이며 처리량이 낮은 실험입니다4. 이 문제를 해결하기 위해 Seibertz et al. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 활동 전위를 측정하기 위해 전압 민감성 염료를 사용하는 프로토콜을 제공합니다5. 이 기술은 광범위한 교육(패치 클램핑에 필요한 경우)이 필요하지 않고 상대적으로 저렴한 실험 설정을 사용하여 적용할 수 있으므로 이 프로토콜은 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다.

심근 세포 외에도 다른 세포 유형(예: 섬유아세포 또는 대식세포)도 전기생리학에서 중요한 역할을 합니다 6,7,8. 전도 시스템에서 세포 유형 특이적 효과를 조사하기 위해 Xia et al. 마우스 9,10에서 부비동 결절(SAN) 및 방실 결절(AVN)을 식별한 다음 대식세포9 또는 전체 마운트 면역형광 이미징을 분리 및 연구하기 위해 미세 해부 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 수행합니다. 이를 통해 다양한 세포 유형의 식별, 3차원 구조의 평가 및 SAN/AVN10 내의 세포 유형 특이적 단백질 발현 연구가 가능합니다.

또한, 다중 전극 어레이(MEA) 기록은 Kumar et al.11에 의해 제시된 것과 같은 전체 마운트 준비에서 수행할 수 있습니다. 이 방법은 비교적 빠르고 간단하며 뛰어난 공간 해상도를 제공하기 때문에 현재 사용되는 기술에 탁월한 추가 기능입니다. 이는 약리학적 개입을 허용하며 심장의 다른 특정 영역(예: AVN)에 쉽게 적용할 수 있습니다.

자율신경계는 전기생리학12,13,14에서 필수적인 역할을 하며 교감신경절제술15,16,17,18 또는 심장신경절 절제술과 같은 치료 전략이 존재합니다19. 그럼에도 불구하고 기계론적 기초는 여전히 많이 알려져 있지 않으며, 특히 자율신경계의 해부학적 구조는 마우스에서 쉽게 접근할 수 없기 때문입니다. 이번 호에서, Scherschel et al. 다양한 세포 유형에서 유전자 및 단백질 발현을 연구하기 위해 마우스에서 성상 신경절의 식별 및 해부를 가능하게 하는 프로토콜을 제공합니다20. 이를 통해 자율신경 리모델링의 새로운 측면을 연구할 수 있습니다.

세포 수준에서 전기생리학을 연구하는 것은 기본 메커니즘을 연구하는 데 중요합니다. 그러나 세포 소견을 검증하고 확인된 표적 구조의 (병리)생리학적 관련성을 확인하기 위해서는 동물 모델에서의 생체 내 연구가 여전히 필요합니다21. 마우스가 가장 널리 사용되지만 특히 형질전환 마우스의 생성은 복잡합니다. 이번 호에서 Shimuraet al. 절단된 단백질의 복잡한 조절 역할과 생체 내 효과를 구체적으로 연구하기 위해 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 이를 위해 그들은 connexin-43을 암호화하는 GJA1 유전자에 단일 점 돌연변이를 포함하는 형질전환 마우스 모델을 생성했습니다. 그 결과 전체 길이 Cx43의 정규 표현이 생성되지만 잘린 Cx4322의 표현이 감소합니다.

생체 내 연구의 주요 한계 중 하나는 실험 중에 동물을 마취해야 한다는 것인데, 이는 다양한 전기생리학적 매개변수에 영향을 미칠 수 있으므로 '진정한' 상황을 나타내지 않을 수 있습니다23,24. 반면에 원격 측정 장치를 사용하면 몇 주에서 몇 달의 장기간에 걸쳐 깨어 있고 자유롭게 움직이는 마우스를 연구할 수 있습니다25,26. Rötzer et al. 특히 자율 신경계와 압반사 민감도를 조사할 수 있는 생쥐의 심박수와 혈압을 동시에 기록하기 위해 원격 측정 장치를 이식하는 방법을 설명합니다27.

원격 측정 장치는 매우 강력한 도구이지만 이러한 대규모 데이터 세트를 분석하는 방법이라는 주요 과제가 남아 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 Tomsits et al. 표준화된 반자동 방식으로 원격 측정 ECG 기록을 분석하는 프로토콜을 개발합니다28. 프로토콜에 따라 연구자는 기본 ECG 매개변수(예: 심박수 또는 PR 간격)를 얻고 개별적으로 정의된 부정맥(예: 일시 중지, 서맥/빈맥)을 선별할 수 있습니다. 중요한 것은 신호 품질을 개선하기 위한 몇 가지 지침을 포함하여 원격 측정 ECG 기록 및 분석의 과제와 함정에 대해서도 논의한다는 것입니다.

인공 판막과 같은 새로 개발된 의료 기기는 인간 환자에게 적용하기 전에 동물 모델에서 철저한 테스트를 거칩니다29. 그러나 건강한 동물에 대한 연구는 인간 환자, 특히 이전에 수술을 받은 적이 있는 환자에게 완벽하게 적용되지 않을 수 있습니다30,31. 이러한 한계를 극복하기 위해 Grab et al. 개별적이고 환자별 심장 모델의 3D 프린팅을 위한 프로토콜을 제공합니다32. 그들의 모델은 탄성이 있고 생체역학적 특성과 인간 환자와 유사한 혈역학적 특성과 유사합니다. 이러한 모델을 통해 의사 교육, 새로운 중재 절차 또는 장치 테스트, 특히 복잡한 해부학적 구조를 가진 환자의 개별화된 치료 전략 계획이 가능합니다.

이 JoVE 방법 컬렉션에 제공된 프로토콜은 전기생리학 및 부정맥을 연구하는 많은 연구자를 지원할 것입니다. 이 컬렉션의 주요 강점은 기존 기술에 대한 개선과 혁신을 제공할 뿐만 아니라 부정맥 발생의 다양한 측면을 연구하기 위한 새로운 접근 방식을 보여준다는 것입니다. 따라서 이 컬렉션은 이러한 복잡한 질병에 대한 이해를 넓히고 궁극적으로 부정맥 환자를 위한 혁신적인 치료법을 개발하는 데 도움이 될 것입니다.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 독일 심혈관 연구 센터(DZHK; 81X2600255, 81X2600270, 81X2600266), 코로나 재단(S199/10079/2019), 심혈관 질환에 대한 ERA-NET(ERA-CVD; 01KL1910) 및 하인리히 및 로테 뮐펜츨 재단의 지원을 받았습니다. 자금 제공자는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

참고문헌

  1. Denham, N. C., et al. Calcium in the pathophysiology of atrial fibrillation and heart failure. Frontiers in Physiology. 9, 1380(2018).
  2. Grandi, E., et al. Human atrial action potential and Ca2+ model: sinus rhythm and chronic atrial fibrillation. Circulation Research. 109 (9), 1055-1066 (2011).
  3. Tomsits, P., Schuttler, D., Kaab, S., Clauss, S., Voigt, N. Isolation of high quality murine atrial and ventricular myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and L-Type calcium current. Journal of Visualized Experiments. (165), e61964(2020).
  4. Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145(2013).
  5. Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-Cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (166), e61890(2020).
  6. Grune, J., et al. Neutrophils incite and macrophages avert electrical storm after myocardial infarction. Nature Cardiovascular Research. 1 (7), 649-664 (2022).
  7. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  8. Xia, R., et al. Cardiac macrophages and their effects on arrhythmogenesis. Frontiers in Physiology. 13, 900094(2022).
  9. Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), e62236(2021).
  10. Xia, R., et al. Whole-Mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058(2020).
  11. Kumar, P., Si, M., Paulhus, K., Glasscock, E. Microelectrode array recording of sinoatrial node firing rate to identify intrinsic cardiac pacemaking defects in mice. Journal of Visualized Experiments. (173), e62735(2021).
  12. Chen, P. S., Choi, E. K., Zhou, S., Lin, S. F., Chen, L. S. Cardiac neural remodeling and its role in arrhythmogenesis. Heart Rhythm. 7 (10), 1512-1513 (2010).
  13. Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
  14. Gardner, R. T., Ripplinger, C. M., Myles, R. C., Habecker, B. A. Molecular mechanisms of sympathetic remodeling and arrhythmias. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (2), 001359(2016).
  15. Dusi, V., De Ferrari, G. M., Pugliese, L., Schwartz, P. J. Cardiac sympathetic denervation in channelopathies. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 27(2019).
  16. Dusi, V., et al. Left cardiac sympathetic denervation for long QT syndrome: 50 years' experience provides guidance for management. JACC Clinical Electrophysiology. 8 (3), 281-294 (2022).
  17. De Ferrari, G. M., et al. Clinical management of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia: The role of left cardiac sympathetic denervation. Circulation. 131 (25), 2185-2193 (2015).
  18. Schwartz, P. J., Ackerman, M. J. Cardiac sympathetic denervation in the prevention of genetically mediated life-threatening ventricular arrhythmias. European Heart Journal. 43 (22), 2096-2102 (2022).
  19. Qin, M., Zeng, C., Liu, X. The cardiac autonomic nervous system: A target for modulation of atrial fibrillation. Clinical Cardiology. 42 (6), 644-652 (2019).
  20. Scherschel, K., et al. dissection, and analysis of the murine stellate ganglion. Journal of Visualized Experiments. (166), e62026(2020).
  21. Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nat Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
  22. Shimura, D., Hunter, J., Katsumata, M., Shaw, R. M. Removal of an internal translational start site from mRNA while retaining expression of the full-length protein. Journal of Visualized Experiments. (181), e63405(2022).
  23. Bennett, K., Lewis, K. Sedation and anesthesia in rodents. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 25 (1), 211-255 (2022).
  24. Poon, Y. Y., et al. Disproportional cardiovascular depressive effects of isoflurane: Serendipitous findings from a comprehensive re-visit in mice. Lab Animal (NY). 50 (1), 26-31 (2021).
  25. Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3260(2011).
  26. McCauley, M. D., Wehrens, X. H. Ambulatory ECG recording in mice. Journal of Visualized Experiments. (39), 10(2010).
  27. Rotzer, R. D., et al. Implantation of combined telemetric ECG and blood pressure transmitters to determine spontaneous baroreflex sensitivity in conscious mice. Journal of Visualized Experiments. (168), e62101(2021).
  28. Tomsits, P., et al. Analyzing long-term electrocardiography recordings to detect arrhythmias in mice. Journal of Visualized Experiments. (171), e62386(2021).
  29. Hytonen, J. P., Yla-Herttuala, S. Preclinical evaluation of coronary artery stents. Journal of Visualized Experiments. (186), e64038(2022).
  30. Gruzdeva, O. V., et al. Comparative analysis of the hemostasiological profile in sheep and patients with cardiovascular pathology as the basis for predicting thrombotic risks during preclinical tests of vascular prostheses. Sovremennye Tekhnologii v Meditsine. 13 (1), 52-56 (2021).
  31. Weisskopf, M., Kron, M., Giering, T., Walker, T., Cesarovic, N. The sheep as a pre-clinical model for testing intra-aortic percutaneous mechanical circulatory support devices. The International Journal of Artificial Organs. 44 (10), 703-710 (2021).
  32. Grab, M., et al. Development and evaluation of 3D-printed cardiovascular phantoms for interventional planning and training. Journal of Visualized Experiments. (167), e62063(2021).

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