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방법 논문

Drosophila 유충의 신경근 접합부의 투과 전자 현미경을 위한 시료 전처리 공정 최적화

1.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64934

⸱

2023년 9월 15일

 ,  ,  ,  , 
1The School of Medicine, Southeast University, 2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 3The School of Life Science and Technology, Southeast University

이 논문에서

정오 공지

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

요약

이 보고서는 Drosophila Larvae의 신경근 접합부를 시각화하기 위한 새로운 샘플 준비 절차를 제공합니다. 이 방법은 기존 방법에 비해 샘플의 말림을 방지하는 데 더 효과적이며 초파리 신경근 접합부 초구조 분석에 특히 유용합니다.

초록

초파리 신경근 접합부(NMJ)는 신경과학 분야에서 가치 있는 모델 시스템으로 부상했습니다. Drosophila NMJ에 컨포칼 현미경을 적용하면 연구자들은 시냅스 풍부도에 대한 정량적 데이터와 시냅스 형태에 대한 자세한 통찰력을 모두 포함하는 시냅스 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나 TEM의 확산 분포와 제한된 가시 범위는 초구조 해석에 어려움을 초래합니다. 이 연구는 기존 접근 방식을 능가하는 혁신적이고 효율적인 샘플 준비 방법을 소개합니다. 이 절차는 바닥이 평평한 병이나 시험관의 바닥에 금속 메쉬를 놓은 다음 고정된 유충 샘플을 메쉬 위에 놓는 것으로 시작됩니다. 추가 메쉬가 샘플 위에 배치되어 두 메쉬 사이에 배치되도록 합니다. 고정 샘플은 임베딩 절차를 진행하기 전에 완전히 탈수되고 침투됩니다. 그런 다음 에폭시 수지에 샘플을 매립하는 것은 평평한 시트 방식으로 수행되어 위치 지정 및 절편을 위한 근육을 준비할 수 있습니다. 이러한 단계를 통해 Drosophila 유충의 모든 근육을 광학 현미경으로 시각화할 수 있어 후속 위치 지정 및 절편을 용이하게 할 수 있습니다. 과도한 수지는 신체 분절 A2 및 A3의 6번째 및 7번째 근육을 찾은 후 제거됩니다. 6번째 또는 7번째 근육의 연속적인 초박형 절편이 수행됩니다.

서론

전자 현미경은 나노 단위 레벨1에서 세포의 내부 구조를 시각적이고 정확하게 보여줄 수 있는 생물학적 물질의 미세 구조를 연구하는 가장 이상적인 방법 중 하나입니다. 그러나 시료 전처리 공정의 복잡성과 높은 비용으로 인해 전자 현미경은 광학 현미경만큼 인기가 없습니다. 최근 전자 현미경 기술의 발전으로 이미지 품질이 크게 향상되었으며, 이와 동시에 관련 작업 부하가 눈에 띄게 감소했습니다. 결과적으로 전자 현미경은 다양한 분야의 과학 지식을 발전시키는 데 중요한 역할을 하게 되었습니다2.

Drosophila는 표적 유전자의 공간적, 시간적 발현을 정밀하게 제어하기 위한 유전자 조작을 수행하기 위한 우수한 동물 모델이다3. 게다가, Drosophila는 포유류 모델에 비해 성장 기간이 짧고 사육이 용이하다는 장점이 있습니다. 따라서 Drosophila는 형태학 연구에서 널리 사용됩니다 4,5.

초파리 유충에서 신경근 접합부(NMJ) 부톤은 근육에 널리 분포되어 있으며(6,7), NMJ의 면역염색은 시냅스의 양과 형태에 대한 정보를 쉽게 제공할 수 있다 8,9 . A2 및 A3 분절의 6/7근육에 위치한 NMJ 부톤은 광학 현미경을 사용한 정량적 및 형태학적 연구에 매우 적합합니다. 이것은 그들의 크기와 풍부함 때문이다10,11. 따라서 초파리 유충 NMJ는 신경과학 연구에 유용한 모델로 간주된다12.

그러나 TEM으로 NMJ bouton 초미세구조를 관찰하는 것은 어렵습니다. 투과 전자 현미경의 스캔 창은 좁기 때문에 널리 분포된 NMJ boutons13을 배치하기가 어렵습니다. 또 다른 이유는 초파리(Drosophila ) 체벽이 시료 전처리 프로토콜7의 알코올 탈수 단계에서 말릴 수 있기 때문이다.

전통적인 연구는 일반적으로 A2 및 A3 세그먼트의 6번째와 7번째 근육 사이의 boutons를 풍부하고 크기14,15 때문에 샘플 재료로 선택했습니다. A2 및 A3 세그먼트의 6번째 및 7번째 근육은 다른 근육보다 크고 더 많은 부톤을 포함합니다. 그러나 전자 현미경을 위해 샘플을 준비할 때 고정 샘플은 얇아지고 말리기 쉬워 A2 및 A3 세그먼트의 6번째 및 7번째 근육의 부적절한 위치로 이어졌습니다.

이로써 우리는 후속 탈수 동안 샘플이 평평하게 유지되도록 함으로써 Drosophila 유충 신경근 접합부의 더 나은 위치 지정을 용이하게 함으로써 기존 샘플 준비 방법 7,16에 비해 샘플의 말림을 방지하는 데 더 효과적인 새로운 처리 절차를 보고합니다.

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프로토콜

참고: 이 기사에서 사용된 투과 전자 현미경 샘플 준비 방법은이전에 보고된 바 있습니다 16. 시약의 선택과 투여량의 조정은 샘플에 따라 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 시료 전처리 공정에는 많은 독성 화학 시약이 사용되므로 작업자는 보호복과 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작동하는 것과 같은 특정 보호 조치를 취해야 합니다.

1. 해부, 고정 및 배치 절차

  1. 해부
    1. 1월 용액에서 떠돌고 있는 3차 후반의 유충을 해부하고 표준 절차에 따라 전신 벽을 얻습니다17. Jan의 용액을 다음과 같이 준비합니다 : 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 35mM 자당, 5mM HEPES, pH 7.4
      참고 : Drosophila 유충의 체벽은 초파리 Drosophila의 유충 단계의 외부 덮개 또는 외피를 나타냅니다. 여기에는 큐티클, 표피 세포 및 유충 외골격을 형성하는 기본 조직이 포함됩니다. 체벽은 구조적 지지와 보호를 제공하며 유충체와 외부 환경 사이의 장벽 역할을 한다17.
  2. 고정
    1. 정착제로 4 °C의 해부실에서 밤새 유충 본체 벽을 고정합니다. 정착제를 준비하려면 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액(pH 7.4)에 2% 글루타르알데히드와 2% 포름알데히드를 혼합합니다.
    2. 카코딜산나트륨 완충액으로 샘플을 여러 번 헹굽니다.
    3. 카코다일레이트 완충액에 1%OsO4 를 준비한다. 샘플을 1% OsO4 에 2시간 동안 고정한 다음 증류수로 여러 번 헹굽니다.
      참고: 알데히드와 OsO4 를 사용한 이중 고정은 세포 초미세 구조를 더 잘 보호합니다. 게다가, OsO4 는 시료 조직을 염색할 수 있어, 빛과 시료 사이의 대비가 더 뚜렷하게 나타날 수 있다18.
    4. Drosophila 신경근 접합부 샘플을 2% 포화 우라닐 아세테이트로 2시간 동안 염색한 다음 탈이온수로 여러 번 헹굽니다(그림 1A).
  3. 시료 배치
    1. 비슷한 크기(기공 크기 270μm)의 둥근 금속 메쉬 두 조각을 가위로 자릅니다.
    2. 바닥이 평평한 병의 바닥에 금속 메쉬(270μm)를 미리 놓습니다.
    3. 고정된 유충 샘플을 메쉬에 놓은 다음 샘플이 두 메쉬 사이에 배치되도록 다른 메쉬를 놓습니다.

2. 탈수

참고 본 논문에서는 에탄올 그래디언트 탈수법을 사용하였다.

  1. 4°C에서 20분 동안 각각 에탄올의 증가하는 농도 구배로 샘플을 순차적으로(50%, 70%, 85%, 95% 각각 한 번, 100% 두 번) 탈수합니다.
  2. 샘플을 실온에서 프로필렌 옥사이드로 매번 5분 동안 두 번 헹굽니다(그림 1C).

3. 침투

참고: 침투는 TEM 샘플 준비에 필요한 단계 중 하나입니다. 침투는 세포 간재를 매끼 매체(19)로 채울 수 있도록 하기 위해 샘플 내의 매매질로 탈수 매체를 점진적으로 교체할 수 있게 한다.

  1. 프로필렌 옥사이드와 에폭시 수지의 혼합 용액에 샘플을 1 : 1 및 1 : 2의 비율로 각각 1 시간 동안 배치 한 다음 실온에서 2 시간 동안 순수 에폭시 수지를 배치합니다.

4. 임베딩

  1. 폴리에틸렌 필름을 준비하고 큰 정사각형 (약 5 × 5cm)과 작은 속이 빈 직사각형 지지대 (약 2 × 2cm)로 자릅니다. 작은 사각형을 큰 사각형에 붙입니다.
  2. 큰 사각형의 중앙에 충분한 에폭시 수지를 미리 배치하십시오.
  3. 근육 쪽이 위쪽을 향하도록 미리 배치된 에폭시 수지에 샘플을 놓습니다. 스테레오스코프를 사용합니다.
  4. 샘플에 수지 몇 방울을 떨어뜨린 다음 PE 필름(스페이서보다 약간 큼)으로 덮습니다(그림 1D-E).
  5. 37 °C, 42 °C 및 60 °C에서 각각 24 시간 동안 샘플을 중합합니다 (그림 1F).

5. 단면화 절차

  1. 날카로운 칼날로 유충 몸체 벽의 과도한 부분을 제거하고 A2/A3 세그먼트를 포함한 사다리꼴을 유지합니다.
    알림: 상단 라인은 13번째 근육 근처에 있어야 하며 기준선은 샘플에서 에폭시 수지까지 떨어져 있어야 합니다. 톱라인과 기준선 사이의 높이는 약 5-8mm입니다.
  2. 샘플의 나머지 부분에서 사다리꼴을 제거하고 A/B 접착제로 수지로 채워진 캡슐에 부착합니다.
  3. 광학 현미경 아래에서 A2 및 A3 세그먼트의 6번째 및 7번째 근육의 위치를 확인하고 (그림 1G) 6번째 근육과 평행 한 접선 평면을 유지합니다.
  4. A3 세그먼트의 양면을 따라 샘플의 1/5을 잘라냅니다.
    알림: 6번째 근육의 대부분을 제거하고 7번째 근육 너비 의 1/3을 유지합니다.
  5. 초박형 마이크로톰을 사용하여 6번째 근육으로 시작하는 샘플의 초박형 부분을 준비합니다.
    참고: 각 슬라이스의 두께는 약 90nm입니다.
  6. 각 구리 메쉬에 가능한 한 많은 슬라이스를 첨부했습니다.
  7. 앞에서 설명한 대로 투과 전자 현미경을 수행합니다16.

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결과

초파리 유충의 몸벽은 규칙적인 패턴으로 배열된 30개의 식별 가능한 근육 섬유로 구성되어 있으며, 절개 및 고정 후 얇은 조각처럼 보인다21(그림 1A). 샘플은 금속 메쉬의 존재로 인해 탈수 과정 중에 평평하게 유지됩니다(그림 1B, C). 유충 몸체 근육은 에폭시 수지로 만든 얇은 판(그림 1D-G)에 묻혀 있으며, 이 판은 수지로 채워진 캡슐에 쉽고 정확하게 배치되고 접착됩니다(그림 1H, I).

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토론

Drosophila 유충 샘플은 샘플이 얇기 때문에 건조 중에 말리는 경향이 있어 신경근 접합부를 정확하게 찾기 어렵고 이로 인해 샘플 준비의 어려움과 작업량이 증가합니다. 전통적인 개선은 샘플7을 줄이는 것이지만 샘플은 여전히 다른 정도로 말려 있습니다.

우리의 방법에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다: 첫째, 샘플은 금속 메쉬의 제한으로 인해 탈수 과정 전반에 걸쳐 평평하게 유지됩니다. 또한, 중합 과정에서 온도 변화로 인해 샘플이 접히는 것을 방지하기 위해 플라스틱 제품 사이에 샘플을 끼워 중합할 수 있으므로 광학 현미경 검사에서 샘플을 쉽게 관찰하고 대상 근육의 위치를 지정할 수 있습니다. 그러나 이 방법의 단점은 수지와 플라스틱 사이의 접착력 때문에 샘플을 회수하기가 쉽지 않다는 것입니다.

우리의 방법으로 얻은 평평한 수지 시트는 기존의 임베디드 블록보다 트리밍 ...

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공개 사항

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국자연과학재단(Natural Science Foundation of China) 보조금 32070811와 동남대학교(중국) 분석 테스트 기금(Southeast University(China) Analysis Test Fund 11240090971)의 지원을 받았습니다. 중국 난징에 있는 동남대학교 의과대학 전자현미경 연구소 및 형태학적 분석 센터에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,2-에폭시프로판SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTDJYJ 037-2015침투제
초파리 주식블루밍턴없음이 연구에 사용된 야생형 제어 초파리 균주는 모두 W1118이며 표준 배양 방법에 따라 사육되었습니다
.없음평평한 바닥 유리 시험관(병)스폰지 플러그(또는 병 마개)가 있는
K4M 크로스 링커  Agar ScientificCat# 1924B임베딩 수지는 고도로 교차 연결된 아크릴레이트와 메타크릴레이트 공식을 기반으로 합니다 
K4M 수지(단량체 B)  Agar ScientificLot # 631557수지 단량체
폴리 비닐 필름Haimen Chenxing 실험 장비 회사 없음투명한 폴리에틸렌 필름은 베스트, 대략 0.2mm
SPI Chem DDSASPISpI#02827-AFDodecenyl 호박 무수물
SPI-Chem DMP-30 에폭시SPI02823-DA가속기
SPI-Chem NMASPISpI#02828-AFHardner 에폭
시 SPI-PON 812 에폭시SPISPI#0259-AB수지 단위체
의 간격입니다스틸 메쉬 Yuhuiyuan Gardening Store(online)없음구리 또는 스테인리스 스틸 그물
투과 전자 현미경Hitachi H-765011416692모든 그리드(샘플이 수집된 곳)는 구연산납으로 염색되고 투과 전자 현미경으로 관찰되었습니다.
초박형 마이크로톰Leica UC7 초박형 마이크로톰595915모든 절편 작업은 다이아몬드 나이프를 사용하여 라이카 UC7 초박형 마이크로톰에서 수행됩니다
.

참고문헌

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재인쇄 및 허가

정오


Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming

to:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan

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