여기에서는 pLEXSY 시스템을 사용하여 안정적인 통합 이식 유전자로서 eGFP에 대한 유전자를 발현하는 L . panamensis 및 L . donovani 균주를 생성하는 데 사용되는 방법론을 설명합니다. 형질주입된 기생충은 희석을 제한하여 클로닝하고, 두 종 모두에서 가장 높은 형광 강도를 갖는 클론을 약물 스크리닝 분석에 추가로 사용하기 위해 선택했습니다.
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방법 논문
eGFP의 구성적 발현을 통한 리슈만편모충 종 균주의 개발
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
리슈만편모충 속의 원생동물 기생충은 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 다양한 임상 증상을 보이는 질병인 리슈만편모충증을 유발합니다. L. donovani에 감염되면 치명적인 내장 질환이 발생할 수 있습니다. 파나마, 콜롬비아 및 코스타리카에서 L. panamensis는 보고된 피부 및 피부 점막 리슈만편모충증 사례의 대부분을 담당합니다. 현재까지 이용 가능한 방법론으로 많은 수의 약물 후보를 연구하는 것은 세포 내 형태의 기생충에 대한 화합물의 활성을 평가하거나 생체 내 분석을 수행하는 데 매우 힘들다는 점을 감안할 때 매우 어렵습니다. 이 연구에서 우리는 18S rRNA(ssu)를 암호화하는 유전자좌에 통합된 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 암호화하는 유전자의 구성적 발현을 가진 L. panamensis 및 L. donovani 균주의 생성을 설명합니다. eGFP를 코딩하는 유전자는 상용 벡터에서 얻었고 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되어 이를 풍부하게 하고 BglII 및 KpnI 효소에 대한 제한 부위를 추가했습니다. eGFP 앰플리콘을 아가로스 겔 정제에 의해 분리하고, 효소 BglII 및 KpnI로 분해하고, 이전에 동일한 효소 세트로 소화된 리슈만편모충 발현 벡터 pLEXSY-sat2.1에 결찰했습니다. 클로닝된 유전자를 가진 발현 벡터를 대장균에 증식시키고, 정제하고, 삽입물의 존재 여부를 콜로니 PCR로 검증하였다. 정제된 플라스미드를 선형화하고, L. donovani 및 L. panamensis 기생충을 형질감염시키는데 사용하였다. 유전자의 통합은 PCR에 의해 검증되었다. eGFP 유전자의 발현을 유세포 분석기로 평가하였다. 형광 기생충은 제한 희석에 의해 클로닝되었고, 형광 강도가 가장 높은 클론은 유세포 분석을 사용하여 선택되었습니다.
서론
리슈만편모충 속의 원생동물 기생충은 광범위한 임상 증상을 보이는 질병인 리슈만편모충증을 유발합니다. 이 질병은 98개국에서 유행하고 있으며, 연간 발병률은 0.9-160만 명으로 추산된다1. 인간에게 병원성인 리슈만편모충 종은 두 개의 아속, 즉 L로 나뉩니다. (리슈만편모충)과 L. (비아니아). L에 속하는 일부 종의 감염. L. donovani와 L. infantum과 같은 (리슈만편모충증) 아속은 내장 리슈만편모충증(VL)을 유발할 수 있으며, 이는 치료하지 않고 방치하면 치명적이다2. L에 속하는 종. (Viannia) 아속은 중남미, 특히 파나마, 콜롬비아 및 코스타리카에서 피부 리슈만편모충증(CL) 및 피부 점막만편모충증(MCL)의 대부분의 사례와 관련이 있으며, L. panamensis는 이러한 임상 증상의 주요 병인이다 3,4.
5가....
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프로토콜
샘플을 멸균 상태로 유지하려면 기생충 배양과 관련된 모든 단계를 생물 안전 레벨 2(BSL-2) 후드 내부 또는 현지 보건 및 안전 규정에 따라 수행해야 합니다. 이 프로토콜의 그래픽 요약은 그림 1에서 찾을 수 있습니다.
그림 1: pLEXSY-2.1 벡터 패밀리를 사용하여 eGFP 발현 L. panamensis 및 L. donovani 기생충을 생성하기 위한 프로토콜의 요약 계획. 이 기사에 설명 된 6 개의 주요 섹션이 모두 여기에 설명되어 있습니다. 1) pLEXSY-2.1 벡터에 eGFP 유전자의 증폭 및 삽입: 표적 유전자를 증폭하여 효소 KpnI 및 BglII에 대한 인식 부위를 추가하고 eGFP 앰플리콘과 pLEXSY 플라스미드를 모두 T4 리....
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결과
pLEXSY-eGFP 구축물을 구축하고 적격한 대장균 세포를 형질전환한 후, eGFP 삽입물이 있는 구축물을 포함하는 콜로니는 섹션 1.2에 설명된 콜로니 PCR을 실행한 후 약 859bp 산물을 생성합니다(그림 3A). SwaI을 사용하여 양성 콜로니에서 정제된 플라스미드의 전체 소화는 겔 전기영동에서 두 가지 특징적인 단편, 즉 대장균에서 복제 및 선택에 필요한 모든 요소를 포함하는 PLEXSY 벡터의 일부인 2.9kbp 단편과 형질감염에 사용되는 선형화된 발현 카세트를 나타내는 7-8kpb 단편을 제공해야 합니다(그림 3B).
형질감염 후, 다클론 선택은 대부분 정성적으로 이루어진다. 항생제로 선택하는 동안 기생충 배양의 상태는 현미경으로 모니터링되어 기생충 형태와 운동성에 특별한주의를 기울입니다. 형질주입된 기생충 배양.......
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토론
다양한 리포터 유전자의 장점과 단점은 여러 원생동물 기생충에서 연구되었습니다. 그 중 GFP와 eGFP는 본질적으로 형광성이며 정량화 및 이미징이 용이합니다. 이러한 단백질의 형광 활성은 형광 현미경, 형광 측정 또는 유세포 분석을 사용하여 최소한의 조작으로 검출할 수 있습니다. GFP 발현 L을 생성하기 위한 연구는 거의 수행되지 않았습니다. (Viannia) 균주는, GFP 및 그 유도체의 견고성이 구세계 리슈만편모충 종15,16,18,24에서 리포터 유전자로 입증되었음에도 불구하고. Varela et al.37은 GFP를 에피솜 이식유전자로 발현하는 L. panamensis 균주를 개발했습니.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panamá, 보조금 번호 NI-177-2016 및 Sistema Nacional de Investigación (SNI), 파나마, 보조금 번호 SNI-169-2018, SNI-008-2022 및 SNI-060-2022.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 96웰 마이크로플레이트 | Corning | CLS3340 | 평평한 바닥 투명, 검은색 폴리스티렌, 멸균, 뚜껑 |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| 암피실린 나트륨 | 염 Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, 세포 배양에 적합 |
| BglII 제한 효소 | New England BioLabs | R0144S | 2,000 단위.10,000 단위/mL |
| 세포 배양 플라스크 | Corning | CLS430168 | 표면적 25 cm2, 경사진 목, 캡(플러그 씰) |
| ChemiDoc 이미징 시스템 | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | 사용할 수 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 분말, BioReagent, 세포 배양에 적합, 곤충 세포 배양에 적합, 식물 세포 배양에 적합, ≥ 99.5% |
| 태아 소 세럼 | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| 젤 로딩 버퍼 | Sigma-Aldrich | G2526 | 이동 속도는 겔 조성에 따라 다릅니다. 적재하기 전에 샘플로 1:3에서 1:6으로 희석합니다. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation 시스템 | Bio-Rad | 1652660 | 이 시스템은 본체, 2개의 액세서리 모듈, 커패시턴스 익스텐더(CE 모듈) 및 펄스 컨트롤러(PC 모듈), ShockPod 큐벳 챔버로 구성됩니다. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | 50 패키지, 0.2 cm– 갭 무균 electroporation 큐벳, 유전자 펄서 및 MicroPulser 시스템과 함께 사용, 포유류 및 기타 진핵 세포 |
| 겐타마이신 용액 | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL 탈 이온수, 액체, 0.1 μ m 필터링, BioReagent, 세포 배양에 적합 |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES 용액 | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, 멸균 필터링, BioReagent, 세포 배양에 적합 |
| 도립 현미경 | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF 제한 효소 | New England BioLabs | R3142S | 4,000 단위. 20,000 단위/mL |
| LB 아가르 | 함유 시그마-알드리치 | L3147 | 고도로 참조된 영양이 풍부한 미생물 성장 분말 매체와 아가르, 일반 대장균 문화. |
| LB 육수 | Sigma-Aldrich | L2542 | 액체 미생물 성장 배지 |
| Mini-Sub Cell GT 수평 전기영동 시스템 | Bio-Rad | 1640300 | Mini 수평 전기영동 시스템, 8웰 및 15웰 빗, 7cm x 10cm UV 투명 트레이 |
| 포함 pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | 의 1회 탠덤 반복과 융합된 eGFP mRNA 발 |
| 키트 | Jena 생명과학 | EGE-1310sat: | 통합 구성 발현 벡터 pLEXSY-sat2.1을 포함합니다. Nourseothricin(NTC, clonNAT)을 사용한 transfectant의 항생제 선택. 진단 PCR 및 염기서열분석을 위한 모든 프라이머가 포함되어 있습니다. |
| 염화칼 | Millipore | 529552 | 분자 생물학 등급 - CAS 7447-40-7 - Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | 최대 15 μ 3 mL 배양액에서 추출한 Transfection-Ready Plasmid g. |
| 슈나이더&프라임; s 곤충 매체 | Sigma-Aldrich | S0146 | Leishmania 배양을 위해 우리 실험실에서 사용되는 배지. |
| SOC 매체 | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| 염화나트륨 | Sigma-Aldrich | S3014 | 분자 생물학, DNase, RNase 및 프로테아제, 검출되지 않음, ≥ 99% (적정) |
| 인산나트륨 이염기성 | 시그마-알드리치 | RDD038 | 바이오 시약, 세포 배양에 적합, 곤충 세포 배양에 적합, ≥ 99.0%, 자유 흐름, Redi-Dri |
| SwaI 제한 효소 | New England BioLabs | R0604S | 2,000 단위. 10,000 단위/mL |
| 주사기 필터 | Corning | CLS431212 | 재생 셀룰로오스 막, 지름. 4 mm, 기공 크기 0.2 &뮤; m |
| T100 열 순환기 | Bio-Rad | 1861096 열 순환기 시스템, 96-웰 열 순환기, 전원 코드, 튜브 지지 링 | |
| 포함 T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | 은 두 개의 DNA 가닥을 응집력 있거나 뭉툭한 끝과 결합합니다 |
| Tris-Borate-EDTA 완충액 | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, 전기영동에 적합, 10× 집중 |
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| Wizard SV 젤 및 PCR 클린업 시스템 | , Promega | A9285 | |
| XL10-Gold, 초역량 세포 | , 애질런트 | 200317 | XL10-Gold, Kanr, 초역량 세포, 10 x 0.1 mL. F' 에피솜에 kanamycin 저항성 유전자가 있어 chloramphenicol-resistant 벡터에서 매우 까다로운 클로닝을 수행할 수 있습니다. 효율성 : > 5 x 10 9 transformants/µ g pUC18 DNA. |
참고문헌
- Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671(2012).
- Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243(2020).
- Saldaña, A., et al.
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