Cell Surface Proteome의 Label-free 정량화를 위한 "Cell Surface Capture" 워크플로우

Summary

여기에서는 다양한 세포 유형의 세포 표면 단백질체의 특성화를 위한 단백질체학 워크플로우에 대해 설명합니다. 이 워크플로우에는 세포 표면 단백질 농축, 후속 시료 전처리, LC-MS/MS 플랫폼을 사용한 분석 및 특수 소프트웨어를 사용한 데이터 처리가 포함됩니다.

Abstract

지난 10년 동안 질량 분석 기반 단백질체학은 광범위한 응용 분야에서 생물학적 시스템의 심층적인 특성화를 가능하게 했습니다. 인간 질병의 세포 표면 단백질체("surfaceome")는 원형질막 단백질이 대부분의 임상적으로 승인된 치료법의 주요 표적일 뿐만 아니라 건강한 조직과 병든 세포를 진단적으로 구별하는 주요 기능이기 때문에 매우 중요합니다. 그러나 세포의 막 및 표면 단백질에 대한 집중적인 특성화는 주로 다른 고농도 단백질에 의해 관심 단백질을 가리는 세포 용해물의 복잡성으로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 이러한 기술적 장벽을 극복하고 질량 분석 단백질체학을 사용하여 다양한 세포 유형의 세포 표면 단백질체를 정확하게 정의하려면 질량 분석기에서 분석하기 전에 세포 표면 단백질의 세포 용해물을 농축해야 합니다. 이 논문은 암세포의 세포 표면 단백질을 라벨링하고, 세포 용해물에서 이러한 단백질을 농축하고, 질량 분석 분석을 위한 후속 시료 준비를 위한 자세한 워크플로우를 제시합니다.

Introduction

단백질은 대부분의 세포 기능이 수행되는 기본 단위 역할을 합니다. 관련 단백질의 구조와 기능을 특성화하는 것은 생물학적 과정을 이해하는 데 필수적인 단계입니다. 지난 10년 동안 질량 분석 기술, 분석 소프트웨어 및 데이터베이스의 발전으로 단백질 차원의 단백질을 정확하게 검출하고 측정할 수 있게 되었습니다¹. 질량 분석 기반 단백질체학은 생화학 경로의 기초 과학 분석부터 중개 환경에서의 새로운 약물 표적 식별, 임상에서의 질병 진단 및 모니터링에 이르기까지 다양한 응용 분야에서 활용될 수 있습니다². 새로운 약물 표적을 스크리닝할 때 세포 표면 단백질체의 특성화가 특히 중요하며, 현재 승인된 인간 약물의 65% 이상이 세포 표면 단백질을 표적으로 합니다³. 암 면역 요법 분야는 또한 종양 세포를 표적으로 하고 특이적으로 제거하기 위해 암 특이적 세포 표면 항원에 전적으로 의존합니다⁴. 따라서 질량 분석 기반 단백질체학은 치료 개입을 위한 새로운 세포 표면 단백질을 식별하는 유망한 도구 역할을 할 수 있습니다.

그러나 기존의 단백질체학 방법을 사용하여 새로운 세포 표면 단백질 표적에 대한 종양 세포를 조사할 때 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 주요 관심사는 표면 단백질이 세포의 전체 단백질 분자 중 매우 작은 부분을 차지한다는 것입니다. 따라서 이러한 단백질의 단편은 전체 세포 용해물^{5의 질량 분석 분석을 수행할 때 높은 양의 세포 내 단백질에 의해 가려집니다}. 이러한 한계로 인해 기존의 단백질체학 워크플로우로 세포 표면 단백질체를 정확하게 특성화하는 것이 어렵습니다. 이 문제를 해결하려면 질량 분석기에서 분석하기 전에 전체 세포 용해물에서 세포 표면 단백질을 농축하는 방법을 개발해야 합니다. 이러한 방법 중 하나는 온전한 세포에서 글리코실화된 세포 표면 단백질의 산화 및 비오틴 라벨링을 포함하고, 이후 뉴트라비딘 풀다운으로 용해물에서 이러한 비오틴화된 단백질을 농축하는 것인데, 이 과정을 "cell surface capture"^{6이라고 합니다}. 포유류 세포 표면 단백질의 ~85%가 glycosylated^{7인 것으로 생각되기 때문에} 이는 전체 세포 용해물에서 세포 표면 단백질체를 농축하는 효과적인 방법으로 사용됩니다. 이 백서에서는 배양된 세포부터 시작하여 세포 표면 비오틴 라벨링과 질량 분석 분석을 위한 후속 시료 준비의 전체 워크플로우를 설명합니다(그림 1). 여러 번의 반복에 걸쳐 이 방법은 특정 샘플의 세포 표면 단백질체에 대한 강력한 커버리지를 제공합니다. 이 방법을 활용하여 종양과 건강한 세포 모두의 세포 표면 단백질체를 특성화하면 새로운 세포 표면 항원의 발견을 촉진하여 잠재적인 면역 치료 표적을 식별할 수 있습니다⁸.

Protocol

참고: 이 세포 표면 단백질체 실험에는 AMO1 형질세포종 세포가 사용되었습니다. 다양한 종류의 현탁액 및 부착 세포주⁹뿐만 아니라 다양한 유형의 1차 샘플^{10을 포함한 다른 세포 유형에도 동일한 프로토콜을 사용할 수} 있습니다. 그러나 세포 수(실험을 위한 출발 물질)는 일반적으로 동등한 단백질체 커버리지를 위해 최적화되어야 합니다. 재료 및 장비에 관한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 완충액 및 시약 용액 및 그 조성에 관한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.

1. 비오틴을 사용한 세포 표면 라벨링

1. 배양된 세포를 계수하고 원심분리(500 × g, 24 °C에서 5분)로 약 3.5 × 10⁷ 살아있는 세포를 펠릿화합니다.
   참고: AMO1 형질세포종(plasmacytoma cell)은 수확 전 3일마다 새로운 배지로 배양되었습니다.
2. 상층액을 흡인하고 1mL의 냉(4°C) Dulbecco의 인산염 완충 식염수(D-PBS)(칼슘 없음, 마그네슘 없음)를 첨가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다.
3. 셀을 다시 펠릿화하고(1.1단계와 같이) 세척 단계(1.2단계)를 한 번 더 반복합니다(총 2회 세척).
4. 두 번째 세척 후 세포를 펠렛화하고(1.1단계와 같이) 부드럽게 피펫팅하여 990μL의 차가운 D-PBS에 재현탁합니다.
5. 사전에 160mM 메타기간산나트륨(NaIO₄)의 원액을 준비합니다. 50 μL 분취량으로 분할하여 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다. 1.4단계에서 160mM 메타존산나트륨 용액 10μL를 세포 현탁액에 첨가하고 철저히 혼합한 후 4°C에서 20분 동안 엔드-투-엔드(end-to-end) 로터에서 배양합니다.
6. 배양이 완료된 후, 세포를 펠렛화하고(1.1단계와 같이), 상층액을 디캔팅한 다음 1mL의 차가운 D-PBS에 재현탁합니다. 이 세척 단계를 두 번 반복합니다(총 3회 세탁). 세 번째 세척 후 989μL의 D-PBS에 세포를 재현탁합니다.
7. 사전에 100mM 바이오사이틴 히드라지드의 원액을 준비합니다. 50 μL 분취량으로 분할하여 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다. 1.6단계에서 아닐린 1μL와 100mM 바이오사이틴 히드라지드 10μL를 세포 현탁액에 첨가하고 완전히 혼합한 다음 4°C에서 60분 동안 엔드 투 엔드 로터에서 배양합니다.
8. 배양이 완료된 후, 세포를 펠렛화하고(1.1단계와 같이), 상층액을 디캔팅한 다음 1mL의 차가운 D-PBS에 재현탁합니다. 이 세척 단계를 두 번 반복합니다(총 3회 세탁).
9. 세 번째 세척 후 피펫으로 상층액을 조심스럽게 흡인하고 튜브를 액체 N₂ 에 넣어 세포 펠릿을 스냅 동결합니다. 동결 펠릿을 -80 °C에 놓고 용해 및 풀다운을 진행할 준비가 될 때까지 기다립니다.

2. 세포 용해 및 비오틴 풀다운

1. 얼어붙은 세포 펠릿을 얼음 위에서 해동합니다.
2. 펠릿에 500μL의 2x 용해 완충액을 추가하고 철저히 혼합한 다음 30초 동안 와류< /> 알림: 펠릿을 완전히 용해시키기 위해 격렬한 피펫팅과 볼텍싱이 필요할 수 있습니다. 일부 불용성 파편(즉, DNA)은 후속 초음파 처리 단계에서 제거되므로 허용됩니다.
3. 얼음 위에서 세포 용해물을 초음파 처리합니다(3회 버스트, 각 20초, 60% 듀티 사이클).
4. 용해물을 원심분리하여 잔여 파편을 펠릿화합니다(17,200에서 10분, 4°C에서 ×g).
5. 용해물이 원심분리되는 동안 100μL의 뉴트라비딘 아가로스 수지 비드를 여과 컬럼에 추가합니다. 컬럼을 진공 매니폴드에 부착하고 부드러운 진공 청소기를 적용한 다음 비드 위에 3mL의 세척 버퍼 1을 흘려 비드를 세척합니다.
6. 진공 매니폴드에서 여과 컬럼을 제거하고 바닥을 덮은 다음 정제된 세포 용해물을 비드가 있는 컬럼에 추가합니다. 컬럼 상단을 덮고 4°C에서 120분 동안 엔드-투-엔드 로터의 비드와 함께 용해물을 배양합니다.
   알림: 컬럼 상단을 캡을 씌울 때 하단 캡을 제자리에 단단히 고정하지 않으면 캡이 빠지고 배양 중에 세포 용해물이 누출될 수 있습니다.
7. 세척 버퍼 1, 2 및 3(샘플당 각 세척 버퍼 약 5mL, 표 1 참조)을 준비하고 42°C 수조에 넣습니다
.
8. 용해물이 배양이 완료된 후 여과 컬럼을 진공 매니폴드에 다시 놓고 부드러운 진공 청소기를 적용한 다음 비드 위에 5mL의 세척 버퍼 1을 흘려 비드를 세척합니다.
   알림: 세척 버퍼의 5mL 이상을 세탁에 사용할 수 있습니다. 추가 세척은 비드에 대한 배경의 비특이적 결합을 줄일 수 있습니다.
9. 5mL의 세척 버퍼 2로 세척 단계를 반복합니다.
10. 5mL의 세척 버퍼 3으로 세척 단계를 반복합니다.
11. 최종 세척 버퍼가 비드를 통해 완전히 흐르면 매니폴드에서 컬럼을 제거합니다. 비드에 100μL의 "Lyse" 용액을 추가하고 피펫을 사용하여 1.7mL 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 짧게 돌려 비드를 침전시키고 침전된 비드를 방해하지 않고 용액 50μL를 제거합니다.
    참고: 이 단계와 모든 후속 단계의 시약은 시중에서 판매되는 단백질체학 시료 전처리 키트를 사용합니다. 이 키트는 최적화되고 간소화된 시료 전처리 워크플로우를 제공합니다. 그러나 이러한 단계는 Verma et al.^{9에 설명된 대로 기존 단백질체학 워크플로우를 사용하여 키트와 독립적으로 수행할 수도} 있습니다. 비드가 컬럼의 측면이나 바닥에 붙어 있는 경우 튜브로 옮겨진 비드가 가라앉을 때까지 하고 튜브에 여분의 "Lyse" 용액을 사용하여 나머지 비드를 옮깁니다.
12. 튜브를 65°C의 열 블록/셰이커에 놓고 1,000rpm으로 10분 동안 흔듭니다.
    참고: 이 단계는 분해 전에 시스테인 잔류물의 환원 및 알킬화에 필요합니다.

3. 단백질 소화

1. "Resuspend" 용액 210μL를 첨가하여 건조된 트립신(키트의 "Digest" 튜브, -20°C에서 보관)을 재현탁합니다. 건조된 모든 트립신이 다시 부유하도록 용액을 위아래로 여러 번 피펫합니다.
2. 배양이 완료된 후 50μL의 재현탁된 트립신 용액을 비드에 추가합니다. 단백질을 소화하기 위해 37°C에서 500rpm으로 최소 90분 동안 흔들어 튜브를 배양합니다.
3. 분해가 완료되면 비드가 포함된 용액을 스핀 컬럼으로 옮기고 컬럼을 1.7mL 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브에 삽입합니다. 튜브를 돌리고(실온[RT]에서 5분 동안 500×g) 분해된 펩타이드 용액을 비드에서 분리합니다.
   참고: 이 단계에서 펩타이드 용액에서 비드가 분리되면 비드에 PNGase 처리를 수행하여 스트렙타비딘 비드에서 비오틴화 펩타이드 단편을 용리할 수 있습니다. 그런 다음 이 펩타이드 샘플은 온비드 트립신화(on-bead trypsinization)의 1차 샘플과 분석 및 비교할 수 있는 별도의 2차 펩타이드 샘플로 워크플로우의 나머지 부분을 통해 전달될 수 있습니다. PNGase 접근법은 MS 검출 가능한 곁사슬 변형을 기반으로 포획된 N-글리코실화 아스파라진에 대한 추가 특이성을 감안할 때 온비드 트립신화에 보완적인 데이터를 제공할 가능성이 높습니다¹². 그러나 이러한 순차 용리 접근법의 단점은 시료 분석당 질량분석기 기기 시간이 두 배로 늘어난다는 것입니다.
4. 100μL의 "Stop" 용액을 첨가하여 분해 반응을 중지하고 펩타이드 용액을 산성화합니다.

4. 펩타이드 탈염

1. 튜브 어댑터를 사용하여 1.7mL 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브에 탈염 컬럼을 배치합니다. 전체 산성화된 펩타이드 용액을 컬럼에 추가합니다. 용액이 컬럼을 통해 흐르도록 컬럼(3분 동안 3,800×g)을 돌립니다. 펩타이드는 이제 컬럼에 결합됩니다. 플로우스루를 폐기합니다.
2. 컬럼에 200μL의 "Wash 1" 용액을 추가하고 회전합니다(3분 동안 3,800×g, RT). 플로우스루를 폐기합니다.
3. 컬럼에 200μL의 "Wash 2" 용액을 추가하고 회전합니다(3분 동안 3,800×g, RT). 플로우스루를 폐기합니다.
4. 컬럼을 라벨이 부착된 새로운 1.7mL 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 컬럼에 100μL의 "용리" 용액을 추가하고 회전합니다(3분 동안 3,800×g, RT). 컬럼에 100μL의 "용리" 용액을 더 추가하고 회전합니다(3분 동안 3,800×g, RT). 이제 펩타이드가 컬럼에서 튜브로 용리됩니다.
5. 펩타이드 용액을 진공 원심분리기에 넣고 밤새 건조시킵니다. 정량화할 준비가 될 때까지 건조된 펩타이드를 -80°C에 놓고 질량분석기에서 분석합니다.

5. 펩타이드 재현탁 및 정량화

1. 건조된 펩타이드를 20μL의 용매 A(0.1% 포름산, 2% 아세토니트릴)에 재현탁합니다.
2. 재현탁 펩타이드(17,200 ×g, 10분 동안)를 원심분리하여 불용성 파편을 펠릿화합니다.
3. 비색 펩타이드 정량 분석을 위한 펩타이드 표준물을 준비합니다.
   1. 5μL의 1,000mg/mL 펩타이드 원액을 96웰 플레이트의 한 웰에 넣습니다.
   2. 웰당 각 표준물질 5μL를 사용하여 탈이온수(DI)로 플레이트에서 1,000mg/mL, 500mg/mL, 250mg/mL, 125mg/mL, 62.5mg/mL, 31.25mg/mL 및 15.625mg/mL와 같은 7단계 연속 희석을 수행합니다. 블랭크를 위해 여덟 번째 웰에 5μL의 DI 물을 놓습니다.
4. 4μL의 DI 물을 96웰 플레이트의 개별 웰 3개에 놓습니다. 총 부피 5 μL.
   에 대해 각 웰에 1 μL의 재현탁 펩타이드 용액을 추가합니다. 알림: 정량화를 위해 펩타이드 용액을 피펫팅할 때 용액 상단에서 조심스럽게 피펫팅하여 침전된 파편이 방해받지 않도록 합니다.
5. 얼마나 많은 작업 시약이 필요한지 계산합니다(웰당 45μL 필요). 필요한 부피의 비색 분석 작업 시약을 준비합니다. 구성 요소의 적절한 혼합을 보장하기 위해 작업 시약을 와류로 만듭니다.
6. 작업 시약 45μL를 각 표준물질 및 샘플 웰에 추가합니다.
   참고: 표준물질을 복제하고 멀티채널 피펫을 사용하여 시약이 웰에 추가되는 타이밍의 차이를 최소화합니다.
7. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
8. 자동 플레이트 리더에서 플레이트를 분석합니다. 표준 샘플에 대해 기록된 흡광도 값을 사용하여 선형 표준 곡선을 생성합니다. 표준 곡선과 R² 값의 방정식을 결정합니다. R2 값이 합리적인 경우(≥0.95) 표준 곡선을 사용하여 비색 분석 플레이트의 5배 희석을 고려하여 재현탁 펩타이드의 농도를 측정합니다.

6. 분해된 펩타이드의 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 분석

1. 용매 A를 첨가하여 펩타이드 샘플의 농도를 0.2μg/μL로 조정하고 10μL를 0.6mL 저단백질 결합 튜브로 옮깁니다.
2. 튜브를 LC 오토샘플러에 넣습니다.
3. 그림 2 및 그림 3에 따라 LC 및 MS/MS 매개변수를 설정합니다.
4. 분석을 위해 5 μL(1 μg)의 펩타이드 샘플을 LC-MS/MS 설정에 주입합니다.
   참고: 여기에 표시된 LC-MS/MS 설정은 그림에만 해당됩니다. LC 및 MS 기기 가용성에 따라 사용자는 LC 그래디언트 및 MS/MS 파라미터에 대한 설정을 수정하여 깊은 단백질체 커버리지를 얻을 수 있습니다. 본 논문에서는 MS 데이터 분석은 MaxQuant https://www.maxquant.org/ 을, 2차 데이터 분석은 Perseus https://maxquant.net/perseus/ 을, 경로 분석은 https://reactome.org/ 를 이용하여 수행하였다.

Results

이 실험에서는 온전한 세포의 N-글리코실화된 막 단백질을 비오틴으로 라벨링하고 전체 세포 용해물에서 이러한 라벨링된 단백질을 뉴트라비딘 풀다운으로 농축하여 종양 세포주의 세포 표면 단백질을 특성화했습니다(그림 1). 또한 LC-MS/MS를 사용하여 단백질체 분석을 수행하여 농축된 세포 표면 단백질을 특성화했습니다. 전체 세포 단백질체 분석과 달리, 여기에서는 세포 표면 단백질만 특성화하는 것이 목표였습니다. 따라서 우리는 3.5 × 10⁷ AMO-1 형질세포종의 샘플 입력으로 시작했습니다. 비색 펩타이드 정량화 분석을 기반으로 ~630ng/μL의 최종 펩타이드 농도를 얻었으며 총 수율은 ~12.6μg의 펩타이드(20μL에서)였습니다(그림 2A). 그런 다음 1μg의 펩타이드 샘플을 LC-MS/MS 시스템에 주입하고 기술적 반복을 위해 주입을 3회 반복했습니다. 사용된 LC 및 MS 매개변...

Discussion

질량 분석 기반 단백질체학은 이전에는 불가능했던 규모로 수천 개의 알려지지 않은 단백질의 편향 없는 특성화를 가능하게 하는 강력한 도구입니다. 이 접근 방식을 통해 특정 샘플에 존재하는 다양한 단백질을 특성화하여 단백질을 식별하고 정량화할 수 있을 뿐만 아니라 세포와 조직의 구조 및 신호 전달 능력에 대한 다양한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 샘플의 글로벌 단백질 프로파일링을 넘어 질량 분석법을 통해 이러한 단백질에 대한 다양한 번역 후 변형(PTM)을 특성화할 수 있으며, DNA 또는 RNA 수준¹에서 분석할 때 사용할 수 없는 신호 전달 경로 및 단백질 역학의 단계를 훨씬 더 깊이 엿볼 수 있습니다. 새로운 암 치료제 개발을 위해 질량 분석 기반 단백질체학을 통해 악성 종양 세포와 건강한 조직의 단백질 프로필을 비교하여 잠재적인 약물 투여 가능한 표적을 식별할 수 있습니다.

빠르게 성장하는 암 면역 요법 분야는 악성 세포 표면에 발현...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kits
96X iST 시료 전처리 키트	PreOmics	P.O.00027	단백질체학 시료 전처리 키트. 환원, 알킬화 및 분해를 위한 시약이 포함되어 있습니다. 또한 탈염 컬럼 및 시약이 포함됩니다.
Pierce 정량 비색 펩타이드 분석	Thermo	23275	펩타이드 정량 분석 키트. 펩타이드 표준물질 및 작업 시약의 구성 요소를 포함합니다.
시약
Acetonitrile	Fisher	A955-1
Ammonium bicarbonate	Millipore Sigma	09830-1KG
Biocytin hydrazide	Biotium	90060
D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003-225B01
Formic Acid	Honeywell	94318
Halt 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 일회용 칵테일	Thermo	1861280
고용량 Neutravidin Agarose 수지	Thermo	29204
인산염 완충 식염수	UCSF 세포 배양 시설	CCFAL001-22J01
RIPA 용해 완충액, 10x	Millipore Sigma	20-188
염화나트륨	Fisher	BP358-212
메타기간산나트륨	Alfa Aesar	13798
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
초순수 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038
Urea (단백질체학 등급)	VWR	M123-1KG
강력한>장비
TC20 자동 세포 계수기	Bio-Rad	1450102
PrismR 마이크로 원심분리기	Labnet International	C2500-R-230V
초음파 발생기	VWR	Branson Sonifier 240
진공 매니폴드	Promega	Promega Vac-Man
쉐이킹 히트블록	Eppendorf	Eppendorf Thermomixer C
엔드-투-엔드 회전기	Labnet	리볼버 조절 가능한 회전기
LC	Thermo	Ultimate 3000 HPLC 및 UHPLC
Q Exactive Plus 하이브리드 사중극자 Orbitrap 질량분석기	Thermo	IQLAAEGAAPfalgmbdk
마이크로플레이트 리더	Biotek	Biotek Synergy 2
진공 농축기	Labconco	7810010
Supplies
1.5 mL Protein LoBind Tubes	Eppendorf	22431081
1.7 mL microcentrifuge tubes
, filtration column,	bio-rad	7326008
spin columns	thermo	69725