여기에서는 다양한 세포 유형의 세포 표면 단백질체의 특성화를 위한 단백질체학 워크플로우에 대해 설명합니다. 이 워크플로우에는 세포 표면 단백질 농축, 후속 시료 전처리, LC-MS/MS 플랫폼을 사용한 분석 및 특수 소프트웨어를 사용한 데이터 처리가 포함됩니다.
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방법 논문
Cell Surface Proteome의 Label-free 정량화를 위한 "Cell Surface Capture" 워크플로우
이 논문에서
요약
초록
지난 10년 동안 질량 분석 기반 단백질체학은 광범위한 응용 분야에서 생물학적 시스템의 심층적인 특성화를 가능하게 했습니다. 인간 질병의 세포 표면 단백질체("surfaceome")는 원형질막 단백질이 대부분의 임상적으로 승인된 치료법의 주요 표적일 뿐만 아니라 건강한 조직과 병든 세포를 진단적으로 구별하는 주요 기능이기 때문에 매우 중요합니다. 그러나 세포의 막 및 표면 단백질에 대한 집중적인 특성화는 주로 다른 고농도 단백질에 의해 관심 단백질을 가리는 세포 용해물의 복잡성으로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 이러한 기술적 장벽을 극복하고 질량 분석 단백질체학을 사용하여 다양한 세포 유형의 세포 표면 단백질체를 정확하게 정의하려면 질량 분석기에서 분석하기 전에 세포 표면 단백질의 세포 용해물을 농축해야 합니다. 이 논문은 암세포의 세포 표면 단백질을 라벨링하고, 세포 용해물에서 이러한 단백질을 농축하고, 질량 분석 분석을 위한 후속 시료 준비를 위한 자세한 워크플로우를 제시합니다.
서론
단백질은 대부분의 세포 기능이 수행되는 기본 단위 역할을 합니다. 관련 단백질의 구조와 기능을 특성화하는 것은 생물학적 과정을 이해하는 데 필수적인 단계입니다. 지난 10년 동안 질량 분석 기술, 분석 소프트웨어 및 데이터베이스의 발전으로 단백질 차원의 단백질을 정확하게 검출하고 측정할 수 있게 되었습니다1. 질량 분석 기반 단백질체학은 생화학 경로의 기초 과학 분석부터 중개 환경에서의 새로운 약물 표적 식별, 임상에서의 질병 진단 및 모니터링에 이르기까지 다양한 응용 분야에서 활용될 수 있습니다2. 새로운 약물 표적을 스크리닝할 때 세포 표면 단백질체의 특성화가 특히 중요하며, 현재 승인된 인간 약물의 65% 이상이 세포 표면 단백질을 표적으로 합니다3. 암 면역 요법 분야는 또한 종양 세포를 표적으로 하고 특이적으로 제거하기 위해 암 특이적 세포 표면 항원에 전적으로 의존합니다4. 따라서 질량 분석 기반 단백질체학은 치료 개입을 위한 새로운 세포 표면 단백질을 식별하는 유망한 도구 역할을 할 수 있습니다.
그러나 기존의 단백질체학 방법을 사용하여 새로운 세포 표면 단백질....
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프로토콜
참고: 이 세포 표면 단백질체 실험에는 AMO1 형질세포종 세포가 사용되었습니다. 다양한 종류의 현탁액 및 부착 세포주9뿐만 아니라 다양한 유형의 1차 샘플10을 포함한 다른 세포 유형에도 동일한 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 그러나 세포 수(실험을 위한 출발 물질)는 일반적으로 동등한 단백질체 커버리지를 위해 최적화되어야 합니다. 재료 및 장비에 관한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 완충액 및 시약 용액 및 그 조성에 관한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.
1. 비오틴을 사용한 세포 표면 라벨링
- 배양된 세포를 계수하고 원심분리(500 × g, 24 °C에서 5분)로 약 3.5 × 107 살아있는 세포를 펠릿화합니다.
참고: AMO1 형질세포종(plasmacytoma cell)은 수확 전 3일마다 새로운 배지로 배양되었습니다. - 상층액을 흡인하고 1mL의 냉(4°C) Dulbecco의 인산염 완충 식염수(D-PBS)(칼슘 없음, 마그네슘 없음)를 첨가하고 위아래로 부드럽게....
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결과
본 실험에서는 라벨링을 통해 종양 세포주의 세포 표면 프로테옴을 특성화하였습니다. N온전한 세포의 당화 막 단백질을 비오틴으로 표지하고, 뉴트라비딘 풀다운(neutravidin pulldown)을 통해 전세포 용해물(whole cell lysate)에서 이러한 표지 단백질을 농축하여(그림 1). 또한, 농축된 세포 표면 단백질을 특성화하기 위해 LC-MS/MS를 이용한 단백질체 분석을 수행하였습니다. 전체 세포 단백질체 분석과 달리, 본 분석의 목적은 세포 표면 단백질만을 특성화하는 것이었습니다. 따라서 3.5 × 10의 시료 투입량으로 시작하였습니다.7 AMO-1 형질세포종 세포. 최종 펩타이드 농도는 ~630 ng/µL 비색법 펩타이드 정량 분석을 기반으로 하였으며, 총 수율은 약 ~12.6 µg 펩타이드의 (in 20 µL) (그림 2A). 그런 다음 우리는 주입했습니다 1 µg 펩.......
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토론
질량 분석 기반 단백질체학은 이전에는 불가능했던 규모로 수천 개의 알려지지 않은 단백질의 편향 없는 특성화를 가능하게 하는 강력한 도구입니다. 이 접근 방식을 통해 특정 샘플에 존재하는 다양한 단백질을 특성화하여 단백질을 식별하고 정량화할 수 있을 뿐만 아니라 세포와 조직의 구조 및 신호 전달 능력에 대한 다양한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 샘플의 글로벌 단백질 프로파일링을 넘어 질량 분석법을 통해 이러한 단백질에 대한 다양한 번역 후 변형(PTM)을 특성화할 수 있으며, DNA 또는 RNA 수준1에서 분석할 때 사용할 수 없는 신호 전달 경로 및 단백질 역학의 단계를 훨씬 더 깊이 엿볼 수 있습니다. 새로운 암 치료제 개발을 위해 질량 분석 기반 단백질체학을 통해 악성 종양 세포와 건강한 조직의 단백질 프로필을 비교하여 잠재적인 약물 투여 가능한 표적을 식별할 수 있습니다.
빠르게 성장하는 암 면역 요법 분야는 악성 세포 표면에 발현.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
LC-MS/MS 런 설정에 도움을 주신 Dr. Kamal Mandal(UCSF 진단검사의학과)님, 데이터 분석을 지원해 주신 Deeptarup Biswas(BSBE, IIT Bombay)님, 데이터 분석을 지원해 주신 Audrey Reeves 박사님(UCSF 진단검사의학과)님께 감사드립니다. A.P.W. 실험실의 관련 작업은 NIH R01 CA226851 및 Chan Zuckerberg Biohub의 지원을 받습니다. 그림 1과 그림 2B는 BioRender.com 를 사용하여 만든 것입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Kits | |||
| 96X iST 시료 전처리 키트 | PreOmics | P.O.00027 | 단백질체학 시료 전처리 키트. 환원, 알킬화 및 분해를 위한 시약이 포함되어 있습니다. 또한 탈염 컬럼 및 시약이 포함됩니다. |
| Pierce 정량 비색 펩타이드 분석 | Thermo | 23275 | 펩타이드 정량 분석 키트. 펩타이드 표준물질 및 작업 시약의 구성 요소를 포함합니다. |
| 시약 | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 일회용 칵테일 | Thermo | 1861280 | |
| 고용량 Neutravidin Agarose 수지 | Thermo | 29204 | |
| 인산염 완충 식염수 | UCSF 세포 배양 시설 | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA 용해 완충액, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| 염화나트륨 | Fisher | BP358-212 | |
| 메타기간산나트륨 | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| 초순수 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (단백질체학 등급) | VWR | M123-1KG | |
| 강력한>장비 | |||
| TC20 자동 세포 계수기 | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR 마이크로 원심분리기 | Labnet International | C2500-R-230V | |
| 초음파 발생기 | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| 진공 매니폴드 | Promega | Promega Vac-Man | |
| 쉐이킹 히트블록 | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| 엔드-투-엔드 회전기 | Labnet | 리볼버 조절 가능한 회전기 | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC 및 UHPLC | |
| Q Exactive Plus 하이브리드 사중극자 Orbitrap 질량분석기 | Thermo | IQLAAEGAAPfalgmbdk | |
| 마이크로플레이트 리더 | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| 진공 농축기 | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | |||
| , filtration column, | bio-rad | 7326008 | |
| spin columns | thermo | 69725 |
참고문헌
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science
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