Method Article

지방 조직 기능 탐구

DOI:

10.3791/64957

⸱

March 3rd, 2023

 , 
1Team Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity and Diabetes, C3M, Université Côte d'Azur, Inserm

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

논의 된 기사 :

Cho, D. S., Doles, J. D. 마우스 부고환 지방 조직에서 지방 전구 세포의 준비. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (162), DOI: 10.3791/61694 (2020).

Peics, J. et al. 쥐 복강 내 지방 저장소에서 지방 생성 및 섬유 염증성 기질 세포 하위 집단의 분리. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (162), DOI: 10.3791/61610 (2020).

Estrada-Gutierrez, G. et al. RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획의 분리. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (164), DOI: 10.3791/61884 (2020).

Gilleron, J. et al. 메틸살리실레이트 클리어링 및 3D 이미징을 통한 지방 조직 구조 탐색. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (162), DOI: 10.3791/61640 (2020).

Czepielewski, R. S. et al. 비만 중 림프 및 혈액 네트워크 분석. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (165), DOI: 10.3791/61814 (2020).

Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, JF 단백질과 마이크로 RNA 조절이 지방 세포 기능에 미치는 영향을 연구하기 위한 지방 세포 배양 모델. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (171), DOI: 10.3791/61925 (2021).

Poret, JM, Molina, PE, Simon, L. 붉은털 원숭이 지방 유래 줄기 세포의 격리, 증식 및 분화. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (171), DOI: 10.3791/61732 (2021).

Batista Jr., M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. 악액질 유발 백색 지방 조직 리모델링을 연구하기 위한 모델로서의 3차원 지방 세포 배양. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (167), DOI: 10.3791/61853 (2021).

Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. 여과 및 초원심분리를 사용한 인간 지방세포 유래 세포외 소포의 분리 및 특성화. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (170), DOI: 10.3791/61979 (2021).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지방 조직(AT) 질량의 증가와 AT 면역 세포의 전염증성 리모델링을 특징으로 하는 비만은 심혈관 질환, 제2형 당뇨병 및 간 질환 발병 위험을 극적으로 증가시키기 때문에 전 세계적으로 주요 공중 보건 문제로 부상했습니다. 따라서 AT 구조와 기능을 탐구하는 것은 중요한 임상적 과제가 되었습니다. 이 방법 모음에서는 생리학적 및 병리학적 조건에서 AT 구조와 기능을 조사하기 위해 개발된 몇 가지 최첨단 방법을 제시합니다.

AT는 성숙한 지방세포, 지방 전구 세포(APC), 섬유 염증 전구 세포(FIP), 내피 세포 및 면역 세포를 포함한 여러 세포 집단으로 구성된 이종 조직입니다. 따라서 이 조직을 특성화하기 위해 단일 세포 표현형을 수행할 수 있습니다. 그들의 기사에서 Choet al. 및 Peics et al. 형광 활성화 세포 분류(FACS)1,2에 의해 마우스 백색 AT 상주 APC를 분리하고 특성화하는 프로토콜을 제공합니다. 이 단계는 AT 확장 용량을 결정하는 데 중요한 요소인 상주 APC의 수를 계산하는 것뿐만 아니라 단일 세포 수준에서 이러한 세포의 기능을 추가로 탐색하는 데에도 중추적인 역할을 합니다. Peics et al. 또한 AT 기능 장애에 역할을 하는 것으로 알려진 전염증성 표현형의 발달에 기여할 수 있는 비지방성 콜라겐 생성 세포인 마우스 백색 AT 상주 FIP2를 분리하는 방법을 제공합니다. 유사하게, Estrada-Gutierrez et al. 인간 내장 AT 생검에서 생존 가능한 성숙 지방세포와 간질 혈관 분획 세포를 동시에 분리하는 프로토콜을 설명합니다3. 전체적으로, 이러한 프로토콜은 인간 및 마우스 AT로부터 단일 세포 현탁액을 생성하기 위한 황금 표준이며, 이는 서로 다른 AT 세포 하위 집단을 추가로 계산하고 기능적으로 표현형화하기 위한 첫 번째 중요한 단계입니다.

구조와 기능 사이의 관계는 AT에서 매우 관련이 있습니다. 비만 중 AT 기능 장애의 특징은 지방 세포 크기의 증가 및 AT의 심오한 리모델링과 관련이 있습니다. 이러한 리모델링은 지방세포와 면역 세포 집단뿐만 아니라 림프통과 혈관 네트워크에도 영향을 미칩니다. 전체 AT에서 이러한 변화를 이해하기 위해 Gilleron et al. 매우 간단하고 저렴하며 빠른 AT 클리어링 프로토콜을 개발합니다4. 이 간단한 프로토콜은 전체 마우스 AT 및 대형 인간 AT 생검의 형태를 3차원적으로 시각화합니다. 여기에는 신경 및 혈관 네트워크, 지방세포, 선천성 및 적응성 면역 세포 분포가 포함되며, 이는 모두 비만 및 관련 병리를 연구하는 데 중요한 매개변수입니다. AT 림프와 혈관에 대한 비만의 영향을 특성화하기 위해 Czepielewski et al. 형광색소 접합 렉틴을 주입하여 림프 수목화와 혈관을 동시에 염색하는 생 체 내 방법을 제공합니다5. 이 프로토콜은 밀도, 부피 및 분기를 포함하여 두 네트워크의 생체 내 형태를 분석하는 방법을 제공합니다. 흥미롭게도, 이 라벨링 전략을 AT 제거 절차4 와 결합하면 전체 마우스 AT를 3차원(3D)5에서 고해상도 매핑할 수 있습니다. 전체적으로 이러한 접근법은 생리학적 및 병태생리학적 조건에서 AT의 구조를 특성화하여 AT 구조와 기능 사이의 상관관계에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

높은 이질성과 엄청난 리모델링 능력으로 인해 생 체 내에서 AT 내 지방세포의 기능을 분석하는 것은 간단하지 않기 때문에 여러 배양 시스템이 개발되었습니다. 이러한 모든 세포 배양 시스템의 주요 장점은 세포 집단과 미세 환경에 대한 높은 수준의 제어입니다. Jageret al. 3T3-L1 분화된 성숙 지방세포에서 RNA 발현을 조작하기 위한 간단한 프로토콜을 개발합니다6. 이 배양 시스템은 이상적인 생리학적 조건과는 거리가 멀지만 3T3-L1 지방세포는 인슐린 신호 전달, 포도당 흡수, 지방 생성 및 지방 분해와 관련하여 기능을 유지합니다. 따라서 이 프로토콜은 단백질 및 비코딩 RNA 발현을 조작하고 지방세포 기능에 대한 역할을 연구할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다. 이상적인 생리학적 조건에 더 가까워지기 위해 Poret et al. 붉은털원숭이 AT7에서 얻은 지방 유래 줄기 세포(ADSC)를 사용하여 기능적 성숙 지방 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 1차 ADSC를 분리하는 방법과 증식 및 분화를 유도하는 방법을 설명합니다. 저자는 또한 이 절차가 다른 종에 적용될 수 있다고 제안합니다. 이 배양 시스템은 3T3-L1 세포주에 비해 이상적인 생리학적 조건에 더 가깝지만, 일차 ADSC에서 유래한 성숙한 지방세포는 생체 내와는 다른 2D로 성장합니다. 이 문제에 대처하기 위해 Batista Jr. et al. 3차원 프린팅 조직 배양 시스템을 위한 효율적인 프로토콜을 제공합니다8. 이 작업에서 저자는 마우스 간질 혈관 분획 세포에서 지방세포를 생성하고 이 3D 배양 시스템 내에서 직접 지방세포 전구체를 분화합니다. 이 접근법은 2D 배양 방법보다 이상적인 생리학적 조건에 돌이킬 수 없을 정도로 더 가깝지만, 스페로이드 중심의 지방세포에 영양분을 공급할 수 있는 혈관의 부족을 고려해야 합니다. 이러한 배양 시스템 내에서 설명된 바와 같이단백질 및 비코딩 RNA 발현을 조절하는 6은 보다 생리학적으로 관련된 지방세포에서 이러한 표적의 기능적 역할에 대한 추가 통찰력으로 이어질 수 있습니다. 그러나 이러한 복잡한 시스템은 아직 확립되지 않았습니다. 이러한 생체 외/시험관 내 배양 시스템의 주요 관심사는 세포에서 분비되는 요인도 포함하는 미세 환경에 대한 높은 수준의 제어입니다. 이와 관련하여 Akbar et al. 인간 지방세포에 의해 분비되는 세포외 소포(EV)를 분리하고 특성화합니다9. 최근 EV는 중요한 대사 조절제인 것으로 밝혀졌습니다. 이 방법은 다양한 대사 상황에서 이러한 지방세포 유래 EV의 대사 영향을 분석하는 데 필수적입니다.

현재 방법 모음에서는 생체 외 및 시험관 내 배양 시스템, 3D 전체 조직 탐색 및 단일 세포 분석을 포함하여 AT 분석의 여러 측면을 다루는 최첨단 프로토콜에 대한 개요를 제공합니다. 완벽한 배양 시스템은 없지만 생물학적 질문에 적합한 배양 시스템을 선택하는 것이 중요합니다. 따라서 이 방법 컬렉션은 시험관 내에서 지방세포를 분리, 분화 및 조작하기 위한 절차의 대규모 도구 상자를 제공합니다. 여기에 설명된 모든 다른 방법을 결합하면 AT의 형태와 기능에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 과학적 지원과 의견을 제시한 Jean-François Tanti와 Mireille Cormont에게 감사를 표합니다. 이 연구는 INSERM, Université Côte d'Azur, 그리고 Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) 프로그램을 통한 프랑스 국립연구청(ANR)의 보조금, 그리고 J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON) 및 J.J. (ANR-20-CE14-0010-01)를 통한 프랑스 국립연구청(ANR)의 보조금으로 지원되었습니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. Journal of Visualized Experiments. (162), e61694(2020).
  2. Peics, J., et al. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (162), e61610(2020).
  3. Estrada-Gutierrez, G., et al. Isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for RNA analysis and macrophage phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (164), e61884(2020).
  4. Gilleron, J., et al. Exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3D imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).
  5. Czepielewski, R. S., et al. Lymphatic and blood network analysis during obesity. Journal of Visualized Experiments. (165), e61814(2020).
  6. Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. An adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-RNA modulation on adipocyte function. Journal of Visualized Experiments. (171), e61925(2021).
  7. Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61732(2021).
  8. Batista, M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Three-dimensional adipocyte culture as a model to study cachexia-induced white adipose tissue remodeling. Journal of Visualized Experiments. (167), e61853(2021).
  9. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Adipose TissueAdipose Progenitor CellsMurine Adipose DepotsViable AdipocytesStromal Vascular FractionObesity AnalysisAdipocyte FunctionExtracellular VesiclesAdipocyte Culture ModelRNA AnalysisMacrophage Phenotyping3D Imaging

Related Articles