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동물과 식물을 포함한 지구상의 모든 다세포 유기체는 ~17억 년 전에 단세포 진핵생물에서 진화했습니다1. 원시 원핵생물과 달리 진핵 세포는 미토콘드리아, 골지 장치, 소포체(ER), 리소좀 및 소포를 포함하여 세포질 내에 막 결합 핵과 많은 막으로 둘러싸인 소기관을 가지고 있습니다. 이 소기관은 특수한 생물학적 기능과 매우 효율적인 대사 활동이 국소화되는 구획을 형성합니다. 광학 현미경의 제한된 해상도로 인해 대부분의 세포 내 소기관에는 빛 회절 한계에 속하는 기능적 구조가 포함되어 있어 시각화가 어렵습니다2. 혁신적인 현미경 및 생물학적 라벨링 기술은 초미세 구조의 고해상도 시각화와 소기관의 생체 내 역학을 가능하게 하기 시작했습니다. 이 컬렉션은 서로 다른 종에 걸쳐 서로 다른 세포 내 소기관을 성공적으로 라벨링하고 이미지화하여 소기관 생물학의 시공간 조절에 대한 이해를 심화시킨 최근 방법을 모았습니다.
최근 수십 년 동안 형광 센서의 개발과 살아있는 세포의 단백질 라벨링은 세포 내 네트워크, 신호 전달 및 세포-세포 상호 작용의 역학에 대한 이해를 크게 촉진했습니다. 첨단 무기 합성 방법을 사용하여 양자점 또는 QD라고도 알려진 나노 규모의 형광 반도체 나노결정이 새로운 종류의 광학 리포터로 발명되었습니다. 일반적으로 QD 입자는 크기가 2-10nm 이내이며 감광성, 안정성이 높으며 세포에 대한 세포독성이 낮습니다. QD 입자는 고해상도로 세포내 과정을 이미징하기 위한 유기 염료 및 형광 단백질의 대안으로 등장했습니다. Aishwarya et al.의 프로토콜에서 저자는 QD 매개 면역 표지에 이어 투과 전자 현미경(TEM)3을 사용한 이미징을 설명합니다. 항체 표적 QD 라벨링 및 TEM 하에서 초해상도로 이미징을 수행함으로써 저자는 성인 마우스 심장 세포의 여러 세포 소기관에서 Sigmar1 국소화를 성공적으로 시각화하고 리소좀과 미토콘드리아 막에 대한 농축을 강조했습니다. 저자는 QD-TEM의 고해상도와 고감도를 강조하는 것 외에도 이 방법의 몇 가지 단점도 언급합니다. 예를 들어, QD 매개 면역표지에 사용되는 사산화오스뮴은 표본의 특성을 비가역적으로 파괴하며, 고정 및 항원 언마스크 단계의 최적화는 고품질 이미지를 보장하기 위한 핵심적이면서도 어려운 요소입니다.
QD 외에도 살아있는 세포의 소기관을 표지하기 위해 다른 많은 염료가 성공적으로 적용되었습니다. 이러한 방법은 생체 내 세포 소기관의 형질전환 또는 전위 과정의 실시간 이미징을 용이하게 했습니다. 때로는 다양한 유형의 소기관을 동시에 시각화하기 위해 여러 소기관 특정 염료가 사용됩니다. Liu, Li et al.4의 프로토콜에서 저자는 MitoTracker Green 및 LysoTracker Red4의 두 가지 다른 염료를 사용하여 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 세포에서 미토콘드리아와 리소좀의 라이브 염색 및 이미징을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 연구에서 두 염료 모두 각각 미토콘드리아와 리소좀에 특이적인 높은 형광 감도와 안정성을 보였습니다. 또한, 저자는 프로토콜을 사용하여 MEF 세포에서 카르보닐 시안화물-4(트리플루오로메톡시) 페닐히드라존(FCCP)에 의해 유도된 미토파지의 중요한 생체 내 세포 과정을 성공적으로 관찰하고 기록했습니다. 토론에서 저자는 염료 농도와 염색 시간을 최적화함으로써 프로토콜이 다른 세포주 또는 조직의 세포에 적용될 수 있다고 언급합니다.
형광 태그에 융합된 소기관 특이적 단백질로 구성된 리포터 구조를 활용함으로써 면역 표지 없이 생체 내 소기관 역학 및 발현 패턴을 관찰할 수 있습니다. Liu, Zhu et al.5의 프로토콜에서 저자는 살아있는 발아 효모인 Saccharomyces cerevisiae5에서 대부분의 유형의 세포 내 소기관을 이미징하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 발아 효모로 작업하는 초보자의 경우, 이 프로토콜은 단백질 세포 내 국소화를 식별하고 타임랩스 이미징을 사용하여 관심 소기관을 추적하는 방법을 배우는 데 도움이 됩니다. 프로토콜의 한계는 프로토콜에 사용된 대부분의 구조가 다른 종의 소기관을 표지하는 데 사용할 수 없다는 것입니다. 다양한 유형의 진핵 세포의 경우, 형광 단백질의 소기관 특이적 패턴은 여전히 항체 면역염색에 의해 검증되어야 합니다.
항체 흡수 분석은 Drosophila notum6의 감각 기관 전구체에서 엔도솜 Notch/Delta 신호 전달의 특정 라이브 라벨링을 위해 처음 개발되었습니다. Notch/Delta 신호 전달의 선량 민감성 특성으로 인해 세포 내에서 리포터 구조를 발현하는 것은 리포터 융합 유전자의 추가 사본이 정상적인 신호 전달을 방해하고 차례로 세포 운명을 방해하기 때문에 생체 내에서 Notch/Delta 신호 전달을 시각화하는 데 적합하지 않습니다. Zhao와 Guo7의 프로토콜에서 저자는 발달 중인 제브라피쉬 뇌7의 방사형 아교세포 전구세포에서 Notch/Delta 엔도좀 트래피킹을 이미징하기 위한 항체 흡수 분석을 적용합니다. 프로토콜에서 항-DeltaD-Atto647N 접합 항체를 24 hpf(수정 후 시간) 배아 후뇌실에 정확하게 미세 주입한 후, 내염색체 트래피킹의 전체 과정을 내재화된 항-DeltaD-Atto647N 항체를 사용하여 기록합니다. 이 연구에서 항체 흡수 분석은 Notch/Delta 신호 전달을 방해하지 않는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜은 관심 단백질의 세포외 도메인에 대한 항체가 이용 가능한 경우 다른 막 리간드-수용체 신호 전달을 시각화하는 데 사용될 수 있습니다.
팽창 가능한 하이드로겔 내에서 샘플을 물리적으로 팽창시키는 것과 관련된 팽창 현미경(ExM)의 최근 개발로 인해 기존의 공초점 현미경을 초고해상도 이미징에 사용할 수 있게 되었습니다. ExM은 발명 이후 다양한 유형의 생물학적 샘플로 테스트되었습니다8. ExM의 주요 과제 중 하나는 중합 및 분해 단계 중 형광 신호 손실입니다. 최근 개발된 라벨 보유 ExM은 삼기능 앵커9의 문제를 해결했습니다. Park et al.10의 프로토콜에서 저자는 삼기능 앵커세트(10)를 사용하여 라벨 보유 ExM(LR-ExM)을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 신호 손실을 방지할 뿐만 아니라 SNAP 또는 CLIP 태그를 사용한 고효율 라벨링을 촉진함으로써 확장 현미경 이미징을 개선합니다. 연구에서 저자는 다양한 세포 내 구조에 대한 다색 LR-ExM을 성공적으로 입증했으며 LR-ExM을 초고해상도 확률론적 광학 재구성 현미경(STORM)과 결합했을 때 단일 분자 분해능을 달성했습니다.
초고해상도 현미경의 빠른 발전과 새로운 형광 표지 기술의 출현으로 우리는 전례 없는 해상도로 세포 내 소기관을 시각화하는 방법과 프로토콜의 추가 개선을 기대할 수 있습니다. 이러한 노력은 세포 내 소기관의 역학과 기능을 이해하는 데 새로운 돌파구를 가져올 준비가 되어 있습니다.