사회적 식민지 케이지 환경 내에서 스스로 시작한 개별 행동 세션에서 데이터를 획득하는 시스템이 제시됩니다. 이 시스템의 효율성은 자동화된 숙련 도달 범위 평가를 사용하여 입증되었으며, 이를 통해 뇌졸중 후 운동 장애, 동기 부여와 관련된 잠재적 행동 변화, 일주기 변동 및 기타 혁신적인 종속 변수의 특성을 파악할 수 있습니다.
방법 논문
뇌졸중 후 결핍을 특성화하기 위해 자가 주도적인 쥐 행동 데이터 수집
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
쥐 모델의 행동 테스트는 심리학, 생물 의학 및 행동 연구를 포함한 다양한 목적으로 자주 활용됩니다. 많은 전통적인 접근 방식에는 단일 연구자와 실험에 참여한 각 동물 간의 개별 일대일 테스트 세션이 포함됩니다. 이 설정은 연구자에게 매우 시간이 많이 소요될 수 있으며, 이의 존재는 원치 않는 방식으로 행동 데이터에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 쥐 연구를 위한 전통적인 케이지는 일반적으로 쥐 종에게 전형적일 수 있는 풍부화, 운동 및 사회화의 부족을 부과하며, 이러한 맥락은 행동 데이터의 결과를 왜곡할 수도 있습니다. 이러한 한계를 극복하는 것은 후천성 뇌 손상 연구를 포함한 여러 연구 응용 분야에서 가치가 있을 수 있습니다. 여기에서는 인간이 없는 군집 케이지에서 개별 쥐의 행동을 자동으로 훈련하고 테스트하기 위한 예제 방법을 제시합니다. 무선 주파수 식별은 개별 쥐에 대한 세션을 조정하는 데 사용될 수 있습니다. 이 시스템의 검증은 뇌졸중 전후에 숙련된 앞다리 운동 성능을 측정하는 예제 컨텍스트에서 이루어졌습니다. 뇌졸중 후 행동 장애의 전통적인 특성과 시스템에 의해 가능해진 새로운 측정이 측정되며, 여기에는 성공률, 당기는 힘의 다양한 측면, 시합 분석, 시작 속도 및 패턴, 세션 지속 시간, 일주기 패턴이 포함됩니다. 이러한 변수는 몇 가지 제한 사항 없이 자동으로 수집할 수 있습니다. 이 장치는 노출, 타이밍 및 실습에 대한 실험적 통제를 제거하지만, 검증은 동물에서 동물로 이러한 변수에서 합리적인 일관성을 생성했습니다.
서론
쥐 모델을 사용한 행동 훈련 및 테스트는 인지 과정 탐색에서 질병 상태 등에 이르기까지 수많은 연구 분야에서 중요합니다1. 일반적으로 이 교육 및 테스트는 단일 동물을 대상으로 일대일 세션으로 수행되며, 연구원은 동물을 집 우리에서 수동으로 제거하고 임시로 일종의 장치에 넣습니다. 불행히도 이 접근 방식에는 몇 가지 어려움과 제한 사항이 있습니다. 첫째, 행동 테스트는 연구자에게 많은 시간이 소요될 수 있으며, 교육이 필요한 경우 그 시간 요구량은 훨씬 더 커집니다. 둘째, 이 접근법은 다른 곳에서 확립된 바와 같이 수집된 데이터에 자동으로 영향을 미치거나 잠재적으로 혼동을 일으킬 수 있습니다2. 이러한 혼란은 농축 관련 변수를 고려할 때 특히 두드러집니다. 구체적으로 말하자면, 실험용 쥐는 전통적으로한두 마리의 쥐가 겨우 들어갈 수 있는 작은 우리에 갇혀 지내는데3, 바퀴가 제공되지 않으면 평생 동안 운동할 기회를 갖지 못할 수 있다. 또한, 고립된 주거는 쥐4와 같은 사회적 종에게 스트레스의 주요 원인이 될 수있다. 이러한 복지 관련 결점 중 일부는 랫트 생리학5,6에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 종의 전형적인행동 표현4의 발달을 선점할 수 있으며, 인간 상황에 적용되는 설치류 모델의 품질에 영향을 미칠 수 있다.
연구자들은 최근 몇 년 동안 이러한 문제에 대한 여러 유형의 해결책을 추구해 왔습니다. 가장 간단한 해결책은 행동 테스트 및 훈련을 자동화하는 것입니다7,8,9,10 따라서 한 명의 연구원이 단일 동물을 돌볼 필요가 없습니다. 추가적인 해결책은 동물을 실험실(11,12)로 자동 이송하는 것이었으며, 이는 인간의 개입의 필요성을 더욱 제거하였다. 마지막으로, 동물들이 다른 동물들과 함께 우리에 갇혀 식민지에 수용될 수 있도록 하고 탐험과 풍부화를 위한 더 많은 공간을 가질 수 있도록 하는 몇 가지 설정이 탐색되었다13. 이러한 장점에도 불구하고, 이러한 콜로니 설정은 개별적으로 차별화된 행동 데이터를 수집하려는 노력을 제한하거나 복잡하게 만들 수 있습니다(컴퓨터 비전을 사용하려는 노력이 참조됨)14,15. 개별 행동 데이터가 필요한 경우, 행동 세션을 위해 콜로니 케이지에서 동물을 식별하고 회수하는 것이 더 어렵거나 복잡할 수 있습니다. 현재, (풍부한) 콜로니 하우징 16,17,18에서 개별 행동 데이터를 수집하기 위한 시스템은 거의 존재하지 않는다.
이러한 단점은 후천성 뇌 손상의 행동 영향에 대한 연구에 특히 영향을 미칠 수 있습니다. 첫째, 인간의 존재 및/또는 성별, 그리고 취급 관행이 설치류의 행동에 영향을 미친다는 것이 분명하다 2,19, 그리고 이러한 변수들은 이전과 비교하여 쥐의 행동에 차별적으로 영향을 미칠 수 있다. 뇌졸중 후. 둘째, 뇌졸중 후 인간의 행동 결과는 재활 운동의 권장 복용량에 대한 참여를 자발적으로 줄임으로써 악화될 수 있다20. 현재 설치류 실험은 이러한 종류의 맥락을 모델링하지 않는 경향이 있는데, 이는 쥐가 행동 세션에 참여하거나 기권할 자유가 없기 때문입니다.
이 기사에서는 enriched colony caging의 틀 내에서 개별 행동 테스트를 용이하게 하도록 설계된 프로토콜을 소개합니다. 이 접근 방식은 현재 관행의 제약을 해결할 뿐만 아니라 혁신적인 조치를 탐색할 수 있는 길을 열어줍니다. ORT(One-Rat Turnstile)가 개발되어 군집 케이지에 부착할 수 있어 동물이 독립적으로 행동 챔버에 들어가 자체 훈련 및 테스트 세션을 시작할 수 있습니다. 이 시스템은 저렴합니다. 각 ORT는 저렴한 비용으로 조립할 수 있습니다(3D 프린터에 대한 액세스 권한 부여). 과거에는 이 시스템의 검증이 기본 조작 챔버를 사용하여 수행되었으며, 이는 동물이 실험자(16)의 존재 없이 간단한 조작 레버 프레스를 수행하도록 일관되게 훈련될 수 있음을 보여주었다. 그럼에도 불구하고 이 구성이 다른 시나리오에 적용되는지 여부에 대한 질문은 해결되지 않은 상태로 남아 있습니다. 목표는 뇌졸중 후 운동 장애와 관련된 숙련된 도달 행동을 교육하고 정량화하기 위해 이전에 확립된 ORT-colony 케이지 설정의 효과를 검증하는 것입니다. 이 구성은 뇌졸중 연구에서 일반적으로 탐구되지 않는 새로운 변수를 생성하는 데 활용되었습니다. 이러한 변수에는 숙련된 도달 과제에 대한 성과 지표와 동기 부여 및 의사 결정과 관련될 수 있는 자기 시작 측정이 포함됩니다. 또한, 전체 24시간 동안 매일 자가 시작의 일주기 패턴에서 뇌졸중으로 인한 변화가 효과적으로 감지되었습니다.
프로토콜
모든 절차와 동물 관리는 University of North Texas 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 National Institutes of Health 가이드를 준수했습니다. 본 연구에서 사용된 성체 수컷 및 암컷 Long-Evans 쥐(400-800g, 1.5세)는 콜로니 케이지에 수용되었습니다.
1. 장비 준비
- 설계 파일 및 시공 지침에 따라 ORT(One-Rat Turnstile)를 구하거나 조립합니다( 보충 파일 1 및 추가 코딩 파일 1 참조). 자세한 내용은 Butcher et al.16 을 참조하십시오.
참고: ORT는 쥐 크기에 따라 다르므로 군집 케이지에는 거의 같은 크기의 동물이 포함되어야 합니다. ORT를 자체 조립하지 않으려면 사전 조립된 상태로 구입할 수 있습니다(재료 표 참조). - 무선 주파수 식별(RFID, 재료 표 참조) 리더를 구하여 부착하고 동물에게 RFID 태그를 주사합니다.
알림: RFID 전이중(FDX) 태그를 주입할 때 쥐가 ORT를 걸을 때 방향은 RFID 안테나에 수직이어야 합니다. 이 검증에서는 태그를 척추와 평행한 평면의 견갑골 사이에 피하로 이식했습니다. - RFID 안테나를 ORT의 튜브에 부착합니다.
- 실험적 질문에 적합한 행동 장치 및 콜로니 케이지를 구성 및/또는 획득합니다. 이 예에서, 맞춤형 콜로니 케이지21,22는 이론적으로 모든 장비를 사용할 수 있지만 상업적으로 이용 가능한 조작 챔버 (재료 표 참조)와 함께 사용되었습니다.
참고: ORT를 통해 행동 장치에 접근하기 위한 식민지 사육 동물의 경쟁을 고려해야 합니다. 4-6마리의 동물당 하나의 ORT + 행동 장치가 필요할 것으로 예상됩니다. - 행동 장치와 콜로니 케이지 사이에 ORT를 부착합니다.
- Dremel 회전 도구( 재료 표 참조) 또는 유사한 도구를 사용하여 행동 장치 및 콜로니 케이지의 포털 구멍을 절단합니다. 내부 지름은 구성된 ORT 터널의 외부 지름과 같아야 합니다.
알림: ORT는 작동하려면 몇 인치 높아야 하므로 콜로니 케이지와 장치 높이를 정렬하기 위해 작은 플랫폼이나 스탠드가 필요합니다. - 동물이 ORT를 통과할 때 읽을 수 있도록 RFID 시스템을 설치하고 원하는 경우 행동 장치와 통합합니다.
2. 수술 전 행동 훈련
- 같은 크기의 쥐 집단을 얻어 콜로니 케이지에 도입합니다.
참고: 고립되거나 동족이 거의 없는 광범위하게 사육되거나 수용된 동물은 특히 식민지 케이지의 사회적 영역을 횡단하는 것과 관련된 경우 챔버를 탐색하는 데 더 많은 어려움을 겪을 수 있습니다. 동물은 이러한 함정을 피하기 위해 일찍부터 집단 우리에 노출되어야 합니다. - 행동 장치 내의 모든 조작자에 대한 접근을 차단하고 챔버가 사용 중일 때 평균 60초마다 보상을 자동으로 전달하도록 설정합니다.
참고 :이 연구는 자당 물 (30 % - 40 %)을 보상으로 사용했지만 가당 연유도 효과적입니다. - 모든 쥐가 ORT를 통해 행동 장치에 정기적으로 들어가도록 훈련시킵니다.
- 적어도 하루에 한 번 데이터를 확인하여 모든 동물이 ORT에 들어가고 있는지 확인하십시오. 동물이 들어가지 않는 경우 펜 크기의 물체를 잠금 장치에 삽입하여 일시적으로 잠기지 않도록 하여 동물이 보다 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다. 동물이 여전히 들어오지 않으면 개찰구를 제거하고 임시 측벽을 부착하여 챔버에 자유롭게 터널로 접근할 수 있도록 합니다.
- 모든 동물이 정기적으로 챔버에 들어가면 자물쇠(및 개찰구)를 반환하고 재평가합니다.
참고: 동물은 다른 쥐로부터 일시적인 휴식을 취하기 위해 ORT와 챔버를 사용할 수도 있습니다. 챔버의 이러한 독점을 선점하는 한 가지 방법은 간단한 격리 챔버에 연결되는 추가 ORT를 부착하는 것입니다. - manipulandum(이 예에서는 당김 핸들)을 도입하고 가장 높은 감도로 설정합니다. 손잡이를 상자 안쪽(최대 2cm) 또는 상자 바로 바깥쪽에 삽입합니다.
알림: Painter의 테이프는 손이 닿지 않는 손잡이 뒷면에 부착하면 도달 시도를 유발할 수 있습니다. - 보상(즉, 30% 자당수)이 자동으로 전달되는 빈도를 줄입니다(예: 90-120초마다). 실험자의 필요와 동물의 선호도에 맞는 모든 보상을 사용할 수 있음을 기억하십시오.
- 모든 동물이 레버를 활성화하는 방법을 배웠는지 확인하기 위해 매일 데이터를 확인하십시오. 모든 동물이 당길 때까지 레버를 미끼로 사용하거나 삽입 수준을 변경하십시오.
- 보상의 자동 전달을 중단하여 풀 핸들의 활성화를 통해서만 사용할 수 있도록 합니다.
- 이전에 삽입한 경우 레버가 챔버 바깥쪽 1cm에서 1.25cm의 최종 위치에 올 때까지 매일 레버를 0.25mm에서 0.5mm씩 집어넣습니다(모든 쥐가 해당 수축 수준에서 계속 당기는 경우).
알림: 레버의 정확한 위치는 쥐의 크기에 따라 다릅니다. 원하는 도달 지형을 얻을 수 있는 위치를 선택해야 합니다. - 백분위수 또는 기타 훈련 프로그램을 시작하여 핸들을 활성화하는 데 필요한 당기는 힘을 점진적으로 증가시킵니다.
참고: 이 연구는 이전 15개 응답의 상위 사분위수에서 강화 기준을 설정하는 백분위수 일정을 사용했습니다. 대안적으로, 잡아당기기 기준의 단계적 증가를 사용할 수 있다7. - 동물이 최종 기준 범위인 120g 당김에 안정적으로 도달하면 백분위수 훈련 프로그램을 제거하고 핸들 활성화 기준을 120g 상수로 고정합니다.
- 성공률이 약 일주일 동안 일정(추세 없음)될 때까지 이 힘 요구 사항에서 기준 데이터를 수집합니다.
3. 뇌졸중 유발
- 모든 식민지 우리에 갇힌 동물에서 동시에 뇌졸중을 외과적으로 유발합니다.
주의: 뇌졸중을 유발하기 위해 뇌졸중의 endothelian-1 모델이 사용되었는데, 이는 다른 곳에서 설명되었다23. - 동물이 3-7일 동안 개별적으로 격리된 전통적인 케이지에서 회복할 수 있도록 합니다.
4. 수술 후 행동 검사
- 회수 후, ORT가 부착된 숙련된 도달 장치를 사용하여 동물을 케이지에 넣어 식민지로 되돌려 보냅니다.
- 뇌졸중 후 결손(1일에서 며칠)을 평가하기에 충분한 데이터가 수집될 때까지 당김 요구 사항을 최종 120g(2단계 수행)으로 유지하면서 행동 테스트를 수행합니다.
- 뇌졸중 후 또는 회복 관련 독립 변수를 동물이 챔버에 접근하는 동안 후속 며칠 동안 구현합니다.
결과
동물들은 한 군집 케이지에서 4 마리의 암컷 쥐와 별도의 식민지 케이지에서 4 마리의 수컷 쥐로 훈련되고 테스트되었습니다. 모든 쥐는 4일 이내에 ORT를 통과하는 법을 배웠다. 4마리의 암컷 쥐는 약 6주간의 훈련 만에 120g의 힘 요구량에서 >85%의 성공적인 시합에 도달했고, 수컷 쥐는 10주 만에 동일한 기준에 도달했습니다(박탈된 쥐를 대상으로 한 표준 훈련의 경우 약 3주)7. 이 교육 기간은 2주에서 6주 사이에 지속적인 문제 해결이 필요한 여러 하드웨어 및 소프트웨어 결함으로 인해 크게 길어졌습니다. 이러한 결함이 해결되자 교육이 원활하게 진행되었으며, 후속 교육 일정은 현재 문헌7과 비슷할 것으로 예상된다. 수컷 쥐는 또한 한 마리의 수컷 쥐가 당기기 시작할 수 있는 더 많은 기회를 제공하기 위해 더 오래 훈련되었습니다. 그러나 그는 끝내 수술을 받지 않았고 7주차 이후 추가 분석 및 수술에서 제외되었습니다. 랫트 성능이 기준선에서 안정되면 각 케이지에 대해 5일간의 뇌졸중 전 기준선 데이터를 얻었습니다. 데이터는 ORT가 하루 종일 케이지에 연결된 상태로 유지되는 날로 제한되었습니다(일부 날은 축산 관련 임시 연결 해제가 필요함). 암컷 케이지의 경우, 기준일은 뇌졸중 전 7, 8, 9, 10, 12일이었습니다. 남성의 경우, 기준일은 뇌졸중 전 8일, 9일, 10일, 11일, 13일이었습니다.
뇌졸중 유도 수술 동안, 이 검증에 참여한 동물은 기저 전뇌(좌표 -5.8mm 전방/후방, 0.7mm 좌측/외측, 8.3mm 등/복측) 또는 복부 피개 영역(좌표 -2.3mm 전방/후방, 3.3mm 좌측 내측/외측, 7.0mm 배측/복부 좌표)의 무선 수신 칩에 연결된 전극을 동시에 이식했습니다. 이 임플란트는 후속 회수 실험에 사용하기 위한 것이며 여기에 보고된 콜로니 케이지-ORT 검증과 관련이 없습니다. 임플란트는 피부가 그 위로 닫힐 수 있도록 설계되었으며, 수신 칩은 왼쪽 팔 아래에 피하에 위치합니다.
암컷 동물 한 마리가 뇌졸중 유도 중에 죽었다. 또 다른 여성은 회복 후 몇 일 후에 쇠약해지기 시작했는데, 뇌졸중 후에는 한 번도 손잡이를 당기지 않았다. 안락사 후, 그녀는 뇌졸중 후 얼마 지나지 않아 뇌출혈을 겪었을 가능성이 있는 것으로 밝혀졌다. 이 두 동물은 뇌졸중 전 평가를 포함한 데이터 세트에서 완전히 제거되었습니다.
뇌졸중 후, 동물들은 ORT를 통해 챔버로 계속 들어갔음에도 불구하고 규칙적인 레버 당기기를 즉시 시작하지는 않았지만 짧은 수동 성형 세션(즉, 레버 거리 감소 및 레버에 접근하거나 레버를 당기려고 시도할 때 보상을 제공)을 통해 격려를 받아야 했습니다. 암컷 쥐는 뇌졸중 후 4-7일 동안 당기지 않았으므로 보조 레버 미끼(즉, 레버에 땅콩 버터를 살짝 묻힘)와 8-11일째에 수동 성형을 제공했습니다. 그들은 11일째 되는 날부터 자율적으로 당기기 시작했습니다. 수컷은 암컷과의 이전 경험을 바탕으로 6일째까지 회복할 수 있었습니다. 그들은 뇌졸중 후 6일째 동안 당기지 않았습니다. 그들은 7일째에 추가 미끼를 받았습니다. 그들은 뇌졸중 후8일째 되는 날부터 자율적으로 당기기 시작했습니다. 동물들이 잡아당기기 시도를 위해 다시 강화대에 연락하자 추가 미끼 또는 성형을 중단하고 뇌졸중 후 데이터를 수집했습니다. 남성은 8일째에 더 복잡한 종속 변수(일주기 측정 및 시합 후 일시 중지)를 완전히 분석할 수 있을 만큼 충분히 당기지 않았으므로 동일한 기준에 따라 9일째, 10일, 11일째에도 계속 당길 수 있었습니다. 8일째 되는 날, 10일째 되는 날, 11일째 되는 날은 온전한 날이었습니다. 뇌졸중 후 당김 첫날은 일주기 분석 및 시합 사이의 일시 중지 분석을 제외한 모든 분석에 사용되었습니다. 이 분석을 위해 암컷의 경우 1일, 수컷의 경우 3일이 사용되었습니다. 뇌졸중 후 분석을 위해 두 마리의 암컷 쥐는 하루에 55회와 844회의 당김을 제공했고, 세 마리의 수컷 쥐는 3일 동안 536회, 153회 및 190회의 당김을 제공했습니다.
데이터는 풀(pull)과 시합(bouts)에 따라 구성되었습니다. 장비 자체에서 발생하는 떨림을 등록하지 않기 위해 +/- 1g 히스테리시스와 함께 5g 임계값을 사용하여 당김을 측정했습니다. 동물이 6g 이상의 압력을 가할 때 당김이 등록되고 손잡이가 4g 미만의 힘을 등록하면 멈췄습니다. 동물들은 여러 차례 빠르게 잡아당기는 경향이 있었다. 한 번의 당김이 120g에 도달하면 보강재가 전달되었습니다. 시합은 피크가 모두 1초 미만으로 떨어져 있는 풀의 클러스터로 간주되었습니다. 이 임계값은 이전 데이터를 기반으로 선택되었으며, 이는 1초 미만의 인터 피크 간격 클러스터가 자연적으로 개발되고 다른 인터 피크 간격이 훨씬 더 길다는 것을 나타냅니다. 쥐는 일반적으로 모이통을 방문하기 전에 연속으로 여러 번 당겼으며, 시합에서 더 일찍 잡아 당겼을 때에도 모이통이 활성화되었습니다.
총 7개의 종속변수를 분석하였다. 기준선 평균과 뇌졸중 후 측정 사이에 쌍체 t-검정 이 수행되었으며, 이는 그림 1, 그림 2 및 그림 3에 보고되어 있습니다. 또한 이 수치는 예상할 수 있는 각 측정값에 대한 일별 및 개체 간의 변동에 대한 인상을 제공하기 위해 개별 동물별 데이터를 표시합니다.
그림 1은 숙련된 도달 범위 평가(skilled reach assessments)7,8,10에서 일반적으로 나타나는 여러 성과 측정에 따른 뇌졸중 전후 수행 능력을 보여준다. 모든 뇌졸중 후 데이터는 충분한 시행 횟수를 수집하는 데 며칠이 걸렸음에도 불구하고 단일 데이터 포인트로 집계되었습니다. 프로토콜과 자동화된 자가 시작 시스템은 시합당 성공률, 시합당 평균 힘, 시합당 당김을 성공적으로 평가했으며, 이들 모두는 다양한 통계적 유의성을 가지고 스트로크에 대한 민감도를 보여주었습니다.
그림 2 는 colony cage-ORT 설정에서 발생하는 두 가지 새로운 변수, 즉 세션 시작과 누적 세션 기간을 보여줍니다. 놀랍게도, 뇌졸중은 세션 시작에 영향을 미치지 않았습니다. 여성은 뇌졸중 전후에 남성보다 더 확실하게 세션을 시작했지만, 뇌졸중 후에는 그 속도에 변화가 없었다. 반대로, 대부분의 쥐는 챔버에서 보내는 시간이 증가했는데, 아마도 시합 성공률이 감소했기 때문일 것입니다(그 결과 보상의 비율이 감소함)
세션 시작(군집 케이지와 식량 강화에서 사용할 수 있는 풍부화와 사회적 보상 사이의 선택을 나타냄)과 챔버에서의 시간(보상의 가치를 가진 조건화된 장소 선호의 경우)도 동기 부여의 지표로 간주될 수 있다 24,25,26,27. 추가적인 동기 부여 기반 측정이 포함되었는데, 예를 들어 세션 분당 당김 수(pulls per session minute)28와 시합 사이의 일시 중지(pauses)29로 정량화된 "노력"과 같은 것들이 포함되었는데, 이는 그림 3에서 볼 수 있다. 이러한 변수들은 뇌졸중의 영향을 받았다. 예상대로 세션 분당 풀 수가 감소하고 시합 사이의 일시 중지 시간이 증가했습니다. 그러나 후자의 조치의 변화는 복잡했습니다. 시합 일시 중지의 분포가 더 혼란스러워진 것 같았으며, 더 긴 일시 중지, 몇 번의 매우 긴 일시 중지, 더 짧은 일시 중지도 포함되었습니다. 이것은 원래 숙련된 모터 장치의 고장을 나타낼 수 있습니다. 그렇다면 쉽게 측정할 수 있는 동일한 지표일 수 있습니다.
작은 그룹 크기에도 불구하고 측정된 변수 중 하나라도 성공률과 상관 관계를 보이는지 확인하기 위해 조사를 수행했으며, 이는 잠재적으로 기능적 중요성을 암시합니다. Shapiro Wilk 테스트는 성공률, 평균 최대 당김, 분당 시합, 누적 세션 지속 시간, 시합 간 일시 중지 및 시합당 당김 변수 변수에 대한 데이터의 균등 분포를 평가하기 위해 수행되었습니다. Shapiro Wilk 검정은 일부 변수의 분포가 정규성에서 유의하게 벗어난 것으로 나타났습니다. 따라서 Spearman의 순위 순서 상관 관계를 수행하여 스트로크 전 또는 사후 성공률과 평균 피크, 분당 당김 시합, 누적 세션 지속 시간, 시합 간 일시 중지 및 시합당 당김 변수 간의 관계를 확인했습니다. 스트로크 전에는 평균 당기는 힘 이외의 변수가 성공률과 유의미한 상관관계가 없었다( 표 1 참조). 뇌졸중 후, 평균 당기는 힘을 제외하고는 대부분의 변수들이 성공률과 유의미한 상관관계를 보이지 않았다(표 1).
마지막으로, ORT는 숙련된 운동 행동뿐만 아니라 일주기 패턴에 대한 분석도 가능하게 합니다. 그림 4는 ORT가 수용된 각 케이지에 대한 각 시간의 비율을 보여주며, 기준선 및 뇌졸중 후 일수에 대한 평균으로 표시됩니다. 그림의 파란색 선은 하루 동안 이루어진 시간당 항목 수의 평균 수를 나타냅니다. 뇌졸중이 발생하기 전까지만 해도, 동물들은 아침에 높은 수준으로 숙련된 도달 과제에 참여하여 하루 종일 지속 시간을 줄였습니다. 조명이 켜지기 몇 시간 전에 참여도가 다시 급증하거나(여성) 매우 약간 증가(남성)하다가 조명이 켜진 직후 중단되었습니다. 이 바이모달 일주기 분포는 뇌졸중 후 완전히 바뀌었습니다. 동물들은 아침에 더 적게 일했고, 방에서 보내는 시간은 하루 중 후반에 최고조에 달했다. 이러한 패턴화는 뇌졸중 후에 자주 관찰되는 일반적인 수면 및 일주기 장애를 반영할 수 있다30,31,32,33.
그림 1: ORT 절차를 사용하여 뇌졸중 후 숙련된 도달 범위의 일반적인 성능 변화를 측정합니다. 뇌졸중 전과 후의 숙련된 도달 거리의 성능을 측정했습니다. 시합당 성공률, 시합당 당김 평균 힘, 시합당 당김 횟수에 대한 동물별 일일 평균은 기준선 5일 동안과 스트로크 후 1일(왼쪽) 동안, 그리고 보고된 쌍체 t-검정을 통해 기준선과 스트로크 후 1일(뇌졸중 후) 평균으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 서로 다른 자가 시작 세션 매개변수는 뇌졸중 후 서로 다른 변화 경향을 보여줍니다. 뇌졸중 전후의 숙련된 도달 행동 세션에 대한 자기 시작 측정은 ORT 절차에 의해 가능해졌습니다. 세션 시작에 대한 동물별 일일 평균 및 누적 일일 세션 기간은 기준선 5일 및 뇌졸중 후 1일(왼쪽) 이상, 보고된 쌍체 t-테스트와 함께 기준선의 평균과 뇌졸중 후 1일(뇌졸중 후) 사이에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 뇌졸중 후 동기 관련 변수 변화. 동기 부여와 관련된 뇌졸중 전후의 숙련된 도달 행동 세션의 성과 측정이 결정되었습니다. 시합 사이의 일시 중지 기간 및 세션 분당 일일 시합 속도에 대한 동물별 일일 평균은 기준선 5일 동안과 뇌졸중 후 1일(왼쪽) 동안, 그리고 보고된 쌍체 t-검정을 통해 기준선과 뇌졸중 후 1일(뇌졸중 후) 평균으로 표시됩니다. 시합 사이의 일시 중지 시간은 이러한 일일 평균과 관련하여 변경되었지만, 더욱 놀라운 것은 뇌졸중 후 개별 일시 중지 길이의 분포도 평균의 양쪽에서 모두 변경되었다는 것입니다. 개별 일시정지 길이는 모든 동물에 대해 풀링되고 로그 축(맨 오른쪽)에 분포로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 뇌졸중 후 자가 시작 세션의 일주기 패턴 변화. 모든 동물, 암컷 및 수컷에 대한 뇌졸중 전(왼쪽)과 후(오른쪽)에 대한 자기 주도 숙련 도달 행동 세션의 일주기 패턴 측정이 결정되었습니다. 이 데이터에는 뇌졸중 전과 뇌졸중 후 일수의 평균을 낸 케이지별 모든 진입 및 챔버 점유 시간이 포함됩니다. 그런 다음 두 케이지의 평균을 다시 구하여 총 분포(맨 윗줄)를 표시합니다. 뇌졸중 이전 패턴에는 아침에 높은 참여도가 포함되었으며, 깨어 있는 시간 동안 감소하여 수면 단계 직전에 새로운 최고조에 달했습니다. 뇌졸중 후 패턴은 세션 지속 시간이 하루 동안 증가하고 수면 단계 전에 최고조에 달한다는 것을 보여줍니다. 쥐들은 그들의 주거 방에서 역광 순환을 하고 있었다. 조명이 켜진 기간은 쥐의 정상적인 비활성 기간을 나타내기 위해 회색으로 음영 처리되어 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 상관 관계 | ||||||
| 변수 | 비교 변수 | 창병 | ||||
| n | 스트로크 전 rs | p | 뇌졸중 후 rs | p | ||
| 평균 당기는 힘 | 성공률 | 5 | 1 | <0.001 | -0.975 | 0.005 |
| 분당 풀 바우트 | 성공률 | 5 | 0.3 | 0.624 | -0.154 | 0.805 |
| 누적 세션 기간 | 성공률 | 5 | -0.1 | 0.873 | 0.564 | 0.322 |
| 시합 사이의 일시 중지 | 성공률 | 5 | -0.6 | 0.285 | 0.205 | 0.741 |
| 시합당 당김 횟수 | 성공률 | 5 | 0.1 | 0.873 | -0.821 | 0.089 |
표 1: 변수 간의 Spearman 상관 계수. 스트로크 전후 성공률 사이의 관계를 결정하기 위해 Spearman의 순위 순서 상관 관계를 수행했으며 평균 피크, 분당 당김 시합, 누적 세션 지속 시간, 시합 간 일시 중지 및 시합당 당김 횟수와 같은 변수를 결정했습니다. 상관 관계 전에 모든 테스트 변수 성공률의 균등 분포를 평가하기 위해 Shapiro Wilk 검정을 수행했으며 일부 변수가 정규성에서 크게 벗어난 것으로 나타났습니다. 스트로크 전에는 평균 당기는 힘 이외의 변수가 성공률과 유의미한 상관관계가 없었다. 이 표는 성공률과 5개의 검정 변수 간에 관계가 있는지 평가한 Spearman 상관 계수(ρ)의 결과를 보여줍니다.
보충 파일 1: ORT를 구축하는 단계. "One Rat Turnstile"을 인쇄하고 구성하기 위한 지침. 지침에는 필요한 모든 자료 목록과 단계별 지침(이미지 포함)이 포함되어 있습니다. 이 파일에는 입구와 출구를 등록하기 위해 마이크로 스위치를 부착하는 방법과 RFID 리더를 부착하기 위한 배선 및 프로그래밍에 대한 지침도 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 1: 여기에는 "One Rat Turnstile"을 3D 프린팅하는 데 필요한 모든 구성 요소가 포함됩니다. 이 파일은 직접 사용하거나 보충 파일 1의 지침에 따라 액세스할 수 있습니다. 이 파일의 모든 구성 요소는 포함된 "눈금자" 부분을 사용하여 크기를 조정해야 합니다(자세한 내용은 보충 파일 1 참조). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
이 프로토콜은 여러 용도로 사용됩니다. 첫째, 그리고 가장 광범위하게, ORT는 사회적이고 풍요로운 주거의 맥락에서 자동화된 단일 피험자 행동 훈련 및 데이터 수집을 가능하게 하기 위해 개발되었습니다. 이 연구는 일반적인 행동 척도를 수집하고 뇌졸중의 맥락에서 자세히 설명하는 아이디어를 테스트했지만 다른 응용 프로그램 및 행동 작업에 대해서도 동일한 작업을 수행할 수 있습니다. 이 검증에서 수집된 조치조차도 대체 강화 일정, 대체 행동 등을 포함하도록 필요에 따라 조정할 수도 있습니다. 둘째, 본 연구는 뇌졸중 후 숙련된 도달 능력의 손상과 관련된 데이터를 수집하는 시스템의 능력을 평가했다. 현재 프로토콜은 기본 레버 누름16을 가르치고 측정하기 위해 이전에 검증되었습니다. 현재 데이터는 이것이 뇌졸중 관련 운동 결손에 대한 데이터를 수집하는 데 유효한 접근 방식이며, 기존의 숙련된 도달 범위 평가의 전형적인 측정과 새로운 측정이 가능하다는 것을 보여줍니다. 콜로니 케이지 ORT 시스템의 문제를 해결하는 동안 큰 질문은 동물이 충분한 빈도로 행동 세션을 스스로 시작하는지, 그리고 특히 뇌졸중 후 다양한 실험 상황에서 그렇게 할 수 있는지 여부였습니다. 모든 또는 거의 모든 동물이 간단한 조작적 절차에 충분히 참여하도록 장려될 수 있으며, 이제는 뇌졸중 후 행동 검사에 참여하도록 권장될 수 있음이 발견되었습니다. 뇌졸중 후 기간에는 약간의 수동 성형이 필요했지만, 동물들은 실험자의 존재 없이도 행동 작업에 빠르게 참여하기 시작했습니다.
문제 해결 중에 성공 가능성을 높이는 몇 가지 절차적 사항이 발견되었으며 이러한 사항이 프로토콜에 통합되었습니다. 여기에는 쥐의 크기에 따라 ORT를 조정하고 동물이 사회적 맥락에서 비슷한 크기와 사육되도록 해야 할 필요성이 포함되었습니다. 또한, 단일 ORT가 챔버에 대한 잠재적인 높은 경쟁으로 인해 4-6마리의 쥐를 수용하는 데 가장 효과적이라는 것이 발견되었습니다. 이 경쟁은 전통적인 방법에 비해 더 큰 스트레스를 유발하지 않는 것으로 보인다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 이전 실험에서는 전통적인 행동 테스트와 달리 콜로니 케이지 설정에서 코르티솔 수치가 감소한 것으로 기록되었습니다16. 또한, 겁이 많은 동물의 경우 초기 훈련 단계에서 개찰구를 제거하거나 잠금 해제 상태로 두면 여러 마리의 쥐가 함께 방을 탐색하는 데 도움이 되는 것으로 나타났습니다.
이 접근법은 뇌졸중 후 운동 결손을 평가하는 데 효과적이지만 몇 가지 제한 사항을 인정하는 것이 중요합니다. 첫째, 뇌졸중 후 동물은 즉시 잡아당기기를 다시 시작하지 않을 수 있으며 몇 번의 수동 성형 및/또는 미끼 작업이 필요할 수 있습니다. 이 접근 방식과 다른 특정 접근 방식을 사용하면 교육 및 테스트의 완전 자동화가 더 어려울 수 있습니다. 그러나 이것은 ORT 콜로니 케이지 설정에 고유한 제한이 아니며 실험자가 시작한 행동 세션의 동물은 종종 동일한 문제를 겪습니다.
또 다른 제한 사항은 의도된 목적 이외의 용도로 챔버를 사용할 가능성입니다. 일화적으로, 동물들이 행동 챔버에 들어가 행동 과제에 적극적으로 참여하지 않고 상당한 시간을 보내는 몇 가지 사례가 관찰되었습니다. 이것은 때때로 모든 동물에서 발생했지만 특히 수컷에게 발생했습니다. 이것은 단순히 ORT가 동물이 사회적 참여를 원하지 않을 때 약간의 사생활을 제공했기 때문일 수 있습니다. 즉, 다른 ORT를 사용하여 콜로니 케이지에 "혼자" 방을 추가하면 이 문제를 완화할 수 있습니다.
또한 동물들이 ORT가 반쯤 열린 상태로 터널에서 때때로 멈추고 일정 시간 동안 거기에 머무는 것이 관찰되었습니다. 이것이 동물이 완전히 들어갈 때까지 동물이 등록되지 않도록 RFID 리더를 행동 챔버 가까이에 두는 것이 가장 좋은 이유입니다. ORT에 머무는 것은 스퀴즈 슈트와 같은 방식으로 즐겁다고 추측 할 수 있습니다. 어쨌든, 동물들은 데이터 수집을 방해할 수 있는 방식으로 그곳에 머물지 않으며, 특히 대체 ORT 부착 격리실을 사용할 수 있는 경우 더욱 그렇습니다.
또 다른 제한 사항은 자체 시작 세션이 그룹 내 개인 간의 행동 세션 시간 또는 행동 응답 기회를 균등화하기가 더 어려울 수 있다는 것입니다. 이러한 제한은 누적 훈련 시간과 회복 사이의 관계를 고려할 때 뇌졸중 관련 연구와 특히 관련이 있을 수 있습니다. 그러나 이 제한은 적어도 부분적으로는 해결할 수 있습니다. 실험이 필요한 경우, 목표 지속 시간 또는 목표 반응 수에 도달했을 때(즉, 보상의 종료 또는 매니풀란덤의 철회를 통해) 세션을 종료하도록 많은 행동 장치를 프로그래밍할 수 있습니다. 이 솔루션은 개인이 목표에 도달하지 못하는 경향을 해결하지 않습니다. 그러나 다시 말하지만, 이러한 제한은 이 설정에만 국한되지 않습니다.
이 설정은 또한 행동 훈련 또는 노출이 몇 가지 제한된 시간이 아닌 하루 종일 발생할 수 있다는 장점이 있습니다. 이것은 여러 상황에서 유용할 수 있습니다. 특히 뇌졸중의 경우 행동 재활 접근법의 투여 효과를 조사하는 데 활용할 수 있습니다.
마지막으로, ORT는 사회적 패배, 강제 수영, 조건화된 두려움 등과 같은 혐오적 절차에 사용될 수 없습니다. ORT는 행동 패러다임이 식욕적이어야 함을 요구합니다. 그렇지 않으면, 동물들은 단순히 행동실을 피할 가능성이 높습니다.
제한 사항에도 불구하고 이 절차는 쥐에 대해 현재 사용 가능한 행동 패러다임에 상당한 이점을 추가합니다. 첫째, 이 설정을 통해 지속적으로 고처리량 데이터를 수집하는 동시에 실험자의 시간을 확보할 수 있습니다. 장비와 동물을 지속적으로 모니터링하는 것이 중요하지만, 실험자는 하루 중 짧은 시간 동안만 현장에 있어야 합니다. 8마리의 동물에 대한 행동 세션을 실행하려면 기존 접근 방식을 사용하여 매일 4-10시간의 세션이 필요했을 것입니다. ORT-colony cage 접근 방식은 그 시간을 실질적으로 0으로 줄일 뿐만 아니라(작동 및 자동화된 장치를 가정할 때) 추가 존재가 거의 필요 없이 주말 동안 데이터 수집을 허용합니다. 주말 동안 행동 활동을 지속적으로 할 수 있다는 것은 동물이 이용할 수 있는 총 풍부화도 증가시킵니다.
ORT-colony cage 프로토콜은 물류상의 이점뿐만 아니라 데이터상의 이점도 제공합니다. 전통적으로 가능하지 않은 많은 종속 변수를 사용할 수 있으며, 여기에는 페이싱, 기간 또는 여기에서 살펴본 것과 같은 자체 시작 세션의 기타 매개변수가 포함됩니다. 일주기 변수는 종종 달리는 바퀴를 사용하여 측정됩니다. 그러나 이 프로토콜을 사용하면 다른 종류의 동작에서 패터닝과 선택 매개 변수를 볼 수 있습니다. ORT는 식민지 케이지를 연결하고 이성에 대한 시각적 또는 후각적 접근을 제공하는 데 사용할 수도 있으며, 이를 통해 동기 부여뿐만 아니라 짝 추구의 일주기 패턴을 평가할 수 있습니다. 본 연구는 뇌졸중 후 발생할 수 있는 의욕 상실 및 우울증과 관련되거나 이와 관련하여 중개 질문을 탐색하는 데 도움이 될 수 있는 일주기 변수 및 시작 관련 변수를 포함하여 뇌졸중 연구에 유용할 수 있는 몇 가지 새로운 종속 변수를 특성화했습니다34,35. 여기서 다루지는 않지만, 도달 거리 운동학의 정성적 분석과 같은 다른 중요한 뇌졸중 관련 변수도 모션 활성화 카메라를 통해 이 ORT 콜로니 케이지 프로토콜로 쉽게 처리할 수 있어야 합니다.
마지막으로, 이 프로토콜의 중요한 장점은 동물이 대부분의 삶 동안 크고 풍부하며 사회적인 환경에 머물 수 있도록 하는 능력입니다. 동물 복지의 진전은 윤리적 이유뿐만 아니라 과학적인 이유로도 기초 실험실에서 중요합니다. 주변을 돌아다니고 사회화할 수 있는 동물은 자연적으로 제한이나 박탈을 수반하지 않는 질병 상태에 대한 더 나은 모델이 되어야 합니다. 또한, 이 프로토콜에서 행동 세션의 자급자족 특성은 행동 데이터가 수집되는 동안 인간이 존재할 필요가 없음을 의미합니다. 실험실에 인간이 존재하는지는 행동 데이터에 영향을 미칠 수 있으며, 때로는 해당 인간, 그들이 얼마나 잘 훈련되었는지, 그리고 동물을 어떻게 다루는지에 따라 다르게 영향을 미칠 수 있다 2,19. 데이터에 대한 이러한 제어되지 않고 가변적인 영향은 현재 프로토콜로 최소화할 수 있습니다.
공개 사항
저자는 공개할 충돌이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 노스 텍사스 대학교 (UNT)의 신경 조작 관계에 관한 연구를 위해 Beatrice H. Barrett 기부금에서 부분적으로 자금을 지원했습니다. Neuroplasticity and Repair Laboratory의 모든 구성원, 특히 Valerie Rojas, Mary Kate Moore, Cameron Scallon 및 Hannah McGee의 의견과 도움에 감사드립니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3D 프린터 | 현지 메이커스페이스 | ||
| 볼트 | Boltdepot | 1346 | 6-32 또는 8-32에 의해 0.5" |
| 볼트 | Boltdepot | 1348 | 6-32 또는 8-32에 의해 0.75" |
| 도어 힌지 | XJS (Amazon) | 43398-16234 | 1" 캐비닛 스테인레스 스틸 도어 힌지 세트에 문의하십시오; 선택 사항("완벽한 경첩"이 인쇄되지 않은 경우) |
| 드릴 | 모든 전기 드릴 작업 | ||
| 확장 스프링 | Nieko (Amazon) | 50456A | ORT 크기 및 원하는 장력 |
| 과립 설탕 | |||
| Boltdepot | 2551 | 6-32 또는 8-32 | |
| 측정 테이프 | |||
| 마이크로컨트롤러 | Arduino | A000066 | Arduino Uno |
| 마이크로스위치 | Sparkfun | KW4-Z5F | 미니 마이크로스위치 (SPDT-롤러 레버) |
| One Rat Turnstile (ORT) | Vulintus | 자체 조립하지 않는 경우 회사에 견적을 요청하십시오 | |
| : 이 실험을 위해 우리는 Vulintus의 자동화된 isometric pull chambers를 사용했습니다. | Vulintus | 고양이 없음 #: Vulintus에 연락하기 | PLA 필라멘트에 대한 견적을 위해 Vulintus에 연락하세요 |
| OVERTURE (아마존) | 영국 MATTEPLA17511 | ||
| 플렉시 글라스 | Lesnlok (아마존) | B09P74K7BR | 투명, 1/8 "두께, |
| 플렉시 글라스 커터 | |||
| 파이썬 프로그램 | Python Software Foundation | 요청 시 사용 가능한 | |
| 소프트웨어 RFID 리더 | 우선 순위 1 디자인 | RFIDRW-E-USB | 안테나 포함 |
| RFID 태그 | 통합 정보 장치 | UC-1485-10 | |
| 막대 | Boltdepot | 23632 | > 3.5"로 절단 |
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