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방법 논문

뇌졸중 후 결핍을 특성화하기 위해 자가 주도적인 쥐 행동 데이터 수집

2.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64967

⸱

2024년 3월 15일

 ,  , 

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

사회적 식민지 케이지 환경 내에서 스스로 시작한 개별 행동 세션에서 데이터를 획득하는 시스템이 제시됩니다. 이 시스템의 효율성은 자동화된 숙련 도달 범위 평가를 사용하여 입증되었으며, 이를 통해 뇌졸중 후 운동 장애, 동기 부여와 관련된 잠재적 행동 변화, 일주기 변동 및 기타 혁신적인 종속 변수의 특성을 파악할 수 있습니다.

초록

쥐 모델의 행동 테스트는 심리학, 생물 의학 및 행동 연구를 포함한 다양한 목적으로 자주 활용됩니다. 많은 전통적인 접근 방식에는 단일 연구자와 실험에 참여한 각 동물 간의 개별 일대일 테스트 세션이 포함됩니다. 이 설정은 연구자에게 매우 시간이 많이 소요될 수 있으며, 이의 존재는 원치 않는 방식으로 행동 데이터에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 쥐 연구를 위한 전통적인 케이지는 일반적으로 쥐 종에게 전형적일 수 있는 풍부화, 운동 및 사회화의 부족을 부과하며, 이러한 맥락은 행동 데이터의 결과를 왜곡할 수도 있습니다. 이러한 한계를 극복하는 것은 후천성 뇌 손상 연구를 포함한 여러 연구 응용 분야에서 가치가 있을 수 있습니다. 여기에서는 인간이 없는 군집 케이지에서 개별 쥐의 행동을 자동으로 훈련하고 테스트하기 위한 예제 방법을 제시합니다. 무선 주파수 식별은 개별 쥐에 대한 세션을 조정하는 데 사용될 수 있습니다. 이 시스템의 검증은 뇌졸중 전후에 숙련된 앞다리 운동 성능을 측정하는 예제 컨텍스트에서 이루어졌습니다. 뇌졸중 후 행동 장애의 전통적인 특성과 시스템에 의해 가능해진 새로운 측정이 측정되며, 여기에는 성공률, 당기는 힘의 다양한 측면, 시합 분석, 시작 속도 및 패턴, 세션 지속 시간, 일주기 패턴이 포함됩니다. 이러한 변수는 몇 가지 제한 사항 없이 자동으로 수집할 수 있습니다. 이 장치는 노출, 타이밍 및 실습에 대한 실험적 통제를 제거하지만, 검증은 동물에서 동물로 이러한 변수에서 합리적인 일관성을 생성했습니다.

서론

쥐 모델을 사용한 행동 훈련 및 테스트는 인지 과정 탐색에서 질병 상태 등에 이르기까지 수많은 연구 분야에서 중요합니다1. 일반적으로 이 교육 및 테스트는 단일 동물을 대상으로 일대일 세션으로 수행되며, 연구원은 동물을 집 우리에서 수동으로 제거하고 임시로 일종의 장치에 넣습니다. 불행히도 이 접근 방식에는 몇 가지 어려움과 제한 사항이 있습니다. 첫째, 행동 테스트는 연구자에게 많은 시간이 소요될 수 있으며, 교육이 필요한 경우 그 시간 요구량은 훨씬 더 커집니다. 둘째, 이 접근법은 다른 곳에서 확립된 바와 같이 수집된 데이터에 자동으로 영향을 미치거나 잠재적으로 혼동을 일으킬 수 있습니다2. 이러한 혼란은 농축 관련 변수를 고려할 때 특히 두드러집니다. 구체적으로 말하자면, 실험용 쥐는 전통적으로한두 마리의 쥐가 겨우 들어갈 수 있는 작은 우리에 갇혀 지내는데3, 바퀴가 제공되지 않으면 평생 동안 운동할 기회를 갖지 못할 수 있다. 또한, 고립된 주거는 쥐4와 같은 사회적 종에게 스트레스의 주요 원인이 될 수있다. 이러한 복지 관련 결점 중 일부는 랫트 생리학5,6에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 종의 전형적인행동 표현4의 발달을 선점할 수 있으며, 인간 상황에 적용되는 설치류 모델의 품질에 영향을 미칠 수 있다.

연구자들은 최근 몇 년 동안 이러한 문제에 대한 여러 유형의 해결책을 추구해 왔습니다. 가장 간단한 해결책은 행동 테스트 및 훈련을 자동화하는 것입니다7,8,9,10 따라서 한 명의 연구원이 단일 동물을 돌볼 필요가 없습니다. 추가적인 해결책은 동물을 실험실(11,12)로 자동 이송하는 것이었으며, 이는 인간의 개입의 필요성을 더욱 제거하였다. 마지막으로, 동물들이 다른 동물들과 함께 우리에 갇혀 식민지에 수용될 수 있도록 하고 탐험과 풍부화를 위한 더 많은 공간을 가질 수 있도록 하는 몇 가지 설정이 탐색되었다13. 이러한 장점에도 불구하고, 이러한 콜로니 설정은 개별적으로 차별화된 행동 데이터를 수집하려는 노력을 제한하거나 복잡하게 만들 수 있습니다(컴퓨터 비전을 사용하려는 노력이 참조됨)14,15. 개별 행동 데이터가 필요한 경우, 행동 세션을 위해 콜로니 케이지에서 동물을 식별하고 회수하는 것이 더 어렵거나 복잡할 수 있습니다. 현재, (풍부한) 콜로니 하우징 16,17,18에서 개별 행동 데이터를 수집하기 위한 시스템은 거의 존재하지 않는다.

이러한 단점은 후천성 뇌 손상의 행동 영향에 대한 연구에 특히 영향을 미칠 수 있습니다. 첫째, 인간의 존재 및/또는 성별, 그리고 취급 관행이 설치류의 행동에 영향을 미친다는 것이 분명하다 2,19, 그리고 이러한 변수들은 이전과 비교하여 쥐의 행동에 차별적으로 영향을 미칠 수 있다. 뇌졸중 후. 둘째, 뇌졸중 후 인간의 행동 결과는 재활 운동의 권장 복용량에 대한 참여를 자발적으로 줄임으로써 악화될 수 있다20. 현재 설치류 실험은 이러한 종류의 맥락을 모델링하지 않는 경향이 있는데, 이는 쥐가 행동 세션에 참여하거나 기권할 자유가 없기 때문입니다.

이 기사에서는 enriched colony caging의 틀 내에서 개별 행동 테스트를 용이하게 하도록 설계된 프로토콜을 소개합니다. 이 접근 방식은 현재 관행의 제약을 해결할 뿐만 아니라 혁신적인 조치를 탐색할 수 있는 길을 열어줍니다. ORT(One-Rat Turnstile)가 개발되어 군집 케이지에 부착할 수 있어 동물이 독립적으로 행동 챔버에 들어가 자체 훈련 및 테스트 세션을 시작할 수 있습니다. 이 시스템은 저렴합니다. 각 ORT는 저렴한 비용으로 조립할 수 있습니다(3D 프린터에 대한 액세스 권한 부여). 과거에는 이 시스템의 검증이 기본 조작 챔버를 사용하여 수행되었으며, 이는 동물이 실험자(16)의 존재 없이 간단한 조작 레버 프레스를 수행하도록 일관되게 훈련될 수 있음을 보여주었다. 그럼에도 불구하고 이 구성이 다른 시나리오에 적용되는지 여부에 대한 질문은 해결되지 않은 상태로 남아 있습니다. 목표는 뇌졸중 후 운동 장애와 관련된 숙련된 도달 행동을 교육하고 정량화하기 위해 이전에 확립된 ORT-colony 케이지 설정의 효과를 검증하는 것입니다. 이 구성은 뇌졸중 연구에서 일반적으로 탐구되지 않는 새로운 변수를 생성하는 데 활용되었습니다. 이러한 변수에는 숙련된 도달 과제에 대한 성과 지표와 동기 부여 및 의사 결정과 관련될 수 있는 자기 시작 측정이 포함됩니다. 또한, 전체 24시간 동안 매일 자가 시작의 일주기 패턴에서 뇌졸중으로 인한 변화가 효과적으로 감지되었습니다.

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프로토콜

모든 절차와 동물 관리는 University of North Texas 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 National Institutes of Health 가이드를 준수했습니다. 본 연구에서 사용된 성체 수컷 및 암컷 Long-Evans 쥐(400-800g, 1.5세)는 콜로니 케이지에 수용되었습니다.

1. 장비 준비

  1. 설계 파일 및 시공 지침에 따라 ORT(One-Rat Turnstile)를 구하거나 조립합니다( 보충 파일 1 및 추가 코딩 파일 1 참조). 자세한 내용은 Butcher et al.16 을 참조하십시오.
    참고: ORT는 쥐 크기에 따라 다르므로 군집 케이지에는 거의 같은 크기의 동물이 포함되어야 합니다. ORT를 자체 조립하지 않으려면 사전 조립된 상태로 구입할 수 있습니다(재료 표 참조).
  2. 무선 주파수 식별(RFID, 재료 표 참조) 리더를 구하여 부착하고 동물에게 RFID 태그를 주사합니다.
    알림: RFID 전이중(FDX) 태그를 주입할 때 쥐가 ORT를 걸을 때 방향은 RFID 안테나에 수직이어야 합니다. 이 검증에서는 태그를 척추와 평행한 평면의 견갑골 사이에 피하로 이식했습니다.
  3. RFID 안테나를 ORT의 튜브에 부착합니다.
  4. 실험적 질문에 적합한 행동 장치 및 콜로니 케이지를 구성 및/또는 획득합니다. 이 예에서, 맞춤형 콜로니 케이지21,22는 이론적으로 모든 장비를 사용할 수 있지만 상업적으로 이용 가능한 조작 챔버 (재료 표 참조)와 함께 사용되었습니다.
    참고: ORT를 통해 행동 장치에 접근하기 위한 식민지 사육 동물의 경쟁을 고려해야 합니다. 4-6마리의 동물당 하나의 ORT + 행동 장치가 필요할 것으로 예상됩니다.
  5. 행동 장치와 콜로니 케이지 사이에 ORT를 부착합니다.
  6. Dremel 회전 도구( 재료 표 참조) 또는 유사한 도구를 사용하여 행동 장치 및 콜로니 케이지의 포털 구멍을 절단합니다. 내부 지름은 구성된 ORT 터널의 외부 지름과 같아야 합니다.
    알림: ORT는 작동하려면 몇 인치 높아야 하므로 콜로니 케이지와 장치 높이를 정렬하기 위해 작은 플랫폼이나 스탠드가 필요합니다.
  7. 동물이 ORT를 통과할 때 읽을 수 있도록 RFID 시스템을 설치하고 원하는 경우 행동 장치와 통합합니다.

2. 수술 전 행동 훈련

  1. 같은 크기의 쥐 집단을 얻어 콜로니 케이지에 도입합니다.
    참고: 고립되거나 동족이 거의 없는 광범위하게 사육되거나 수용된 동물은 특히 식민지 케이지의 사회적 영역을 횡단하는 것과 관련된 경우 챔버를 탐색하는 데 더 많은 어려움을 겪을 수 있습니다. 동물은 이러한 함정을 피하기 위해 일찍부터 집단 우리에 노출되어야 합니다.
  2. 행동 장치 내의 모든 조작자에 대한 접근을 차단하고 챔버가 사용 중일 때 평균 60초마다 보상을 자동으로 전달하도록 설정합니다.
    참고 :이 연구는 자당 물 (30 % - 40 %)을 보상으로 사용했지만 가당 연유도 효과적입니다.
  3. 모든 쥐가 ORT를 통해 행동 장치에 정기적으로 들어가도록 훈련시킵니다.
  4. 적어도 하루에 한 번 데이터를 확인하여 모든 동물이 ORT에 들어가고 있는지 확인하십시오. 동물이 들어가지 않는 경우 펜 크기의 물체를 잠금 장치에 삽입하여 일시적으로 잠기지 않도록 하여 동물이 보다 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다. 동물이 여전히 들어오지 않으면 개찰구를 제거하고 임시 측벽을 부착하여 챔버에 자유롭게 터널로 접근할 수 있도록 합니다.
  5. 모든 동물이 정기적으로 챔버에 들어가면 자물쇠(및 개찰구)를 반환하고 재평가합니다.
    참고: 동물은 다른 쥐로부터 일시적인 휴식을 취하기 위해 ORT와 챔버를 사용할 수도 있습니다. 챔버의 이러한 독점을 선점하는 한 가지 방법은 간단한 격리 챔버에 연결되는 추가 ORT를 부착하는 것입니다.
  6. manipulandum(이 예에서는 당김 핸들)을 도입하고 가장 높은 감도로 설정합니다. 손잡이를 상자 안쪽(최대 2cm) 또는 상자 바로 바깥쪽에 삽입합니다.
    알림: Painter의 테이프는 손이 닿지 않는 손잡이 뒷면에 부착하면 도달 시도를 유발할 수 있습니다.
  7. 보상(즉, 30% 자당수)이 자동으로 전달되는 빈도를 줄입니다(예: 90-120초마다). 실험자의 필요와 동물의 선호도에 맞는 모든 보상을 사용할 수 있음을 기억하십시오.
  8. 모든 동물이 레버를 활성화하는 방법을 배웠는지 확인하기 위해 매일 데이터를 확인하십시오. 모든 동물이 당길 때까지 레버를 미끼로 사용하거나 삽입 수준을 변경하십시오.
  9. 보상의 자동 전달을 중단하여 풀 핸들의 활성화를 통해서만 사용할 수 있도록 합니다.
  10. 이전에 삽입한 경우 레버가 챔버 바깥쪽 1cm에서 1.25cm의 최종 위치에 올 때까지 매일 레버를 0.25mm에서 0.5mm씩 집어넣습니다(모든 쥐가 해당 수축 수준에서 계속 당기는 경우).
    알림: 레버의 정확한 위치는 쥐의 크기에 따라 다릅니다. 원하는 도달 지형을 얻을 수 있는 위치를 선택해야 합니다.
  11. 백분위수 또는 기타 훈련 프로그램을 시작하여 핸들을 활성화하는 데 필요한 당기는 힘을 점진적으로 증가시킵니다.
    참고: 이 연구는 이전 15개 응답의 상위 사분위수에서 강화 기준을 설정하는 백분위수 일정을 사용했습니다. 대안적으로, 잡아당기기 기준의 단계적 증가를 사용할 수 있다7.
  12. 동물이 최종 기준 범위인 120g 당김에 안정적으로 도달하면 백분위수 훈련 프로그램을 제거하고 핸들 활성화 기준을 120g 상수로 고정합니다.
  13. 성공률이 약 일주일 동안 일정(추세 없음)될 때까지 이 힘 요구 사항에서 기준 데이터를 수집합니다.

3. 뇌졸중 유발

  1. 모든 식민지 우리에 갇힌 동물에서 동시에 뇌졸중을 외과적으로 유발합니다.
    주의: 뇌졸중을 유발하기 위해 뇌졸중의 endothelian-1 모델이 사용되었는데, 이는 다른 곳에서 설명되었다23.
  2. 동물이 3-7일 동안 개별적으로 격리된 전통적인 케이지에서 회복할 수 있도록 합니다.

4. 수술 후 행동 검사

  1. 회수 후, ORT가 부착된 숙련된 도달 장치를 사용하여 동물을 케이지에 넣어 식민지로 되돌려 보냅니다.
  2. 뇌졸중 후 결손(1일에서 며칠)을 평가하기에 충분한 데이터가 수집될 때까지 당김 요구 사항을 최종 120g(2단계 수행)으로 유지하면서 행동 테스트를 수행합니다.
  3. 뇌졸중 후 또는 회복 관련 독립 변수를 동물이 챔버에 접근하는 동안 후속 며칠 동안 구현합니다.

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결과

동물들은 한 군집 케이지에서 4 마리의 암컷 쥐와 별도의 식민지 케이지에서 4 마리의 수컷 쥐로 훈련되고 테스트되었습니다. 모든 쥐는 4일 이내에 ORT를 통과하는 법을 배웠다. 4마리의 암컷 쥐는 약 6주간의 훈련 만에 120g의 힘 요구량에서 >85%의 성공적인 시합에 도달했고, 수컷 쥐는 10주 만에 동일한 기준에 도달했습니다(박탈된 쥐를 대상으로 한 표준 훈련의 경우 약 3주)7. 이 교육 기간은 2주에서 6주 사이에 지속적인 문제 해결이 필요한 여러 하드웨어 및 소프트웨어 결함으로 인해 크게 길어졌습니다. 이러한 결함이 해결되자 교육이 원활하게 진행되었으며, 후속 교육 일정은 현재 문헌7과 비슷할 것으로 예상된다. 수컷 쥐는 또한 한 마리의 수컷 쥐가 당기기 시작할 수 있는 더 많은 기회를 제공하기 위해 더 오래 훈련되었습니다. 그러나 그는 끝내 수술을 받지 않았고 7주차 이후 추가 분석 및 수술에서 제외되었습니다. 랫트 성능이 ...

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토론

이 프로토콜은 여러 용도로 사용됩니다. 첫째, 그리고 가장 광범위하게, ORT는 사회적이고 풍요로운 주거의 맥락에서 자동화된 단일 피험자 행동 훈련 및 데이터 수집을 가능하게 하기 위해 개발되었습니다. 이 연구는 일반적인 행동 척도를 수집하고 뇌졸중의 맥락에서 자세히 설명하는 아이디어를 테스트했지만 다른 응용 프로그램 및 행동 작업에 대해서도 동일한 작업을 수행할 수 있습니다. 이 검증에서 수집된 조치조차도 대체 강화 일정, 대체 행동 등을 포함하도록 필요에 따라 조정할 수도 있습니다. 둘째, 본 연구는 뇌졸중 후 숙련된 도달 능력의 손상과 관련된 데이터를 수집하는 시스템의 능력을 평가했다. 현재 프로토콜은 기본 레버 누름16을 가르치고 측정하기 위해 이전에 검증되었습니다. 현재 데이터는 이것이 뇌졸중 관련 운동 결손에 대한 데이터를 수집하는 데 유효한 접근 방식이며, 기존의 숙련된 도달 범위 평가의 전형적인 측정과 새로운 측정이 가능하다는 것을 보여줍니다. 콜로니 케이지 ORT 시스...

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공개 사항

저자는 공개할 충돌이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 노스 텍사스 대학교 (UNT)의 신경 조작 관계에 관한 연구를 위해 Beatrice H. Barrett 기부금에서 부분적으로 자금을 지원했습니다. Neuroplasticity and Repair Laboratory의 모든 구성원, 특히 Valerie Rojas, Mary Kate Moore, Cameron Scallon 및 Hannah McGee의 의견과 도움에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3D 프린터 현지 메이커스페이스
볼트Boltdepot13466-32 또는 8-32에 의해  0.5"
볼트Boltdepot13486-32 또는 8-32에 의해  0.75"
도어 힌지XJS (Amazon)43398-162341" 캐비닛 스테인레스 스틸 도어 힌지 세트에 문의하십시오; 선택 사항("완벽한 경첩"이 인쇄되지 않은 경우)
드릴모든 전기 드릴 작업
확장 스프링Nieko (Amazon)50456AORT 크기 및 원하는 장력
과립 설탕
Boltdepot25516-32 또는 8-32
측정 테이프
마이크로컨트롤러ArduinoA000066Arduino Uno
마이크로스위치SparkfunKW4-Z5F미니 마이크로스위치 (SPDT-롤러 레버)
One Rat Turnstile (ORT)Vulintus자체 조립하지 않는 경우 회사에 견적을 요청하십시오
: 이 실험을 위해 우리는 Vulintus의 자동화된 isometric pull chambers를 사용했습니다.Vulintus고양이 없음 #: Vulintus에 연락하기PLA 필라멘트에 대한 견적을 위해 Vulintus에 연락하세요
 OVERTURE (아마존)영국 MATTEPLA17511
플렉시 글라스Lesnlok (아마존)B09P74K7BR투명, 1/8 "두께,
플렉시 글라스 커터
파이썬 프로그램Python Software Foundation요청 시 사용 가능한
소프트웨어 RFID 리더우선 순위 1 디자인RFIDRW-E-USB안테나 포함
RFID 태그통합 정보 장치UC-1485-10
막대Boltdepot23632> 3.5"로 절단
회전 도구ORT를 위한 장치 및 식민지 케이지에 구멍을 뚫는 데 사용; 모든 하드웨어 사용 가능한
모래 종이HSYMQ (Amazon)TOMPOL-1118-1915-11
소켓 렌치 세트모든 소켓 렌치 세트 작동
납땜 인두
슈퍼 접착제234790
와이어Plusivo (아마존)EAN0721248989789
잠금 너트에 따라 스프링 선택 및 조정 행동 평가를 위해 원하는 대로 Operant Chambers를

참고문헌

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