TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

본 프로토콜은 고분자 지지 액적 계면 이중층(DIB) 막 ^1,2,3에서 막 이동성과 막 단백질의 이온 채널 투과성 사이의 상관관계를 연구하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다.

본 기술은 단일 입자 추적^4,5, 형광 상관 분광법 ^6,7 및 고속 원자력 현미경 8,9,10과 같은 고급 광학 및 표면 분석 도구의 인상적인 배열을 보완합니다. 이는 막 기반 반응에 영향을 미치는 막의 동적 구성과 구조에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다^11,12,13. 단백질의 이동과 측면 확산은 막에 있는 단백질의 국소 밀도에 따라 달라지지만, 개별 단백질 분자는 지질 뗏목(¹⁴)과 단백질-단백질 상호작용^(15,16)에 의해 갇힐 수도 있다. 막에서 세포외 환경 또는 세포질로 돌출된 단백질 도메인에 따라 단백질 이동성은 이동성이 높은 것부터 완전히 움직이지 않는 것까지 다양할 수 있습니다. 그러나, 멤브레인과 그 주변 구조의 복잡성으로 인해, 측면 이동성의 특성과 단백질 기능 사이의 상호작용을 해독하는 것은 종종 어렵다¹⁷.

DIB 멤브레인은 멤브레인 단백질 18,19,20,21,22의 생물물리학적 단일 분자 분석을 위한 효율적인 플랫폼임이 입증되었습니다. 이들은 지질/유상에서 수성 방울과 하이드로겔 지지 기질의 접촉을 통한 지질 자가 조립에 의해 형성됩니다. 일반적으로 사용되는 지지된 지질 이중층(SLB)1,23,24,25과 유사하게^, DIB는 적절한 리간드로 기능화될 때 단백질을 중합체 매트릭스에 일시적 또는 영구적으로 결합시킴으로써 측면 이동성의 국소 조정을 허용한다⁽¹⁷). 후자는 이질적인 단백질 분포를 갖는 세포막에서 생화학적 과정을 위한 모델 시스템 역할을 할 수 있다¹⁰.

여기에 기술된 실험적 접근법은 TIRF 현미경을 사용하여 멤브레인^(2,22)에 근접한 개별 채널을 통한 Ca2+ 이온 플럭스를 측정하기 위해^Ca2+-민감성 염료의 형광에 의존한다. 이 광학적 접근 방식은 샘플의 조명을 멤브레인에 가까운 거리로 제한하며, 이는 소멸 여기 광의 물리적 특성으로 인해 형광 배경을 크게 감소시킵니다. 후자는 단일 분자의 검출을 위해 높은 공간 및 시간 분해능이 필요한 경우 전제 조건입니다. 고전적인 전기생리학적 방법(^26,27)과 달리^, 개별 채널을 통한 이온 플럭스를 연구하기 위해 멤브레인 전압이 필요하지 않습니다. 또한, 이 방법은 멤브레인에서 채널의 측면 이동을 방해할 수 있는 형광 염료 또는 분자로 표지할 필요가 없습니다.

이 방법은 고전적인 전기 생리학을 사용하지 않고 단일 분자 수준에서 멤브레인에 내장된 단백질 채널을 연구하는 데 특히 유용합니다. Neurospora crassa^28,29,30의 미토콘드리아 단백질 전도 채널 TOM-CC와 대장균^17,31의 외막을 가로질러 작은 친수성 분자의 확산을 지원하는 OmpF를 사용하여 두 단백질의 막 이동성과 채널 활성을 연구하고 상관시킬 수 있는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 TOM-CC 및 OmpF에 최적화되어 있지만 다른 단백질 채널에 쉽게 적용될 수 있음을 시사합니다.

1. 단백질 생산

참고: 이 섹션에서는 LamB 및 OmpC가 없는 대장균 BE BL21(DE3) omp6^31,32에서 OmpF를 분리하는 절차와 Neurospora crassa에서 TOM 코어 복합체를 분리하는 절차를 설명합니다(그림 1)^28,29. 후자는 TOM 서브유닛^Tom22(도 1A)의 6xHis-표지된 형태를 함유하는 N. crassa 균주 28로부터 분리된 미토콘드리아를 필요로 하며, 이는 기재된 바와 같이 분리될 수 있다(²⁸). 다음 프로토콜은 일반적으로 1-2mg의 N. crassa TOM-CC와 10mg의 대장균 OmpF를 생성합니다. 양을 조절하려면 단백질/세제 비율을 정확하게 유지하는 것이 중요합니다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 단계는 4°C에서 수행되어야 합니다.

1. TOM 코어 복합체의 분리
   1. Bausewein et al.30에 따르면 약 1.5kg(습윤 중량) 균사로부터 차등 침전으로 얻은 정제된 N. crassa 미토콘드리아(단백질 2g)를 20mM Tris-HCl(pH 8.5), 1%(w/v) DDM, 20%(v/v) 글리세롤, 300mM NaCl, 20mM 이미다졸 및 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF) 중 4°C에서 ³⁰분 동안.
      주의 : PMSF는 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
   2. 가용화된 미토콘드리아를 초원심분리기 튜브로 옮기고 4°C에서 40분 동안 130,000 x g 에서 초원심분리하고 표준 등급 여과지로 여과하여 가용화된 막 단백질에서 가용화되지 않은 막을 분리합니다.
   3. 자동 단백질 정제 시스템을 사용하여 사전 충전된 Ni-NTA 컬럼(부피 5mL)을 완충액 A1(표 1)의 약 5컬럼 부피(CV)와 평형을 이룹니다. 모든 단계에서 1mL/분의 일정한 유속으로 Ni-NTA 컬럼을 실행합니다. 단백질이 2g 미만의 미토콘드리아에서 분리된 경우 더 낮은 부피의 컬럼(1mL)을 사용합니다.
   4. 가용화된 단백질 샘플을 1mL/분의 유속으로 Ni-NTA 컬럼에 로드합니다.
   5. Ni-NTA 컬럼을 버퍼 A1의 5CV로 세척하여(표 1) 결합되지 않은 단백질을 제거하였다.
   6. His-tagged TOM-CC를 30% 완충액 A2로 용리하고(표 1; 300 mM 이미다졸) 280 nm 크로마토그램에 나타나는 단백질 피크를 수집하였다(도 1B).
   7. TOM-CC의 추가 정제를 위해 자동 단백질 정제 시스템을 사용하여 버퍼 B1, B2 및 B1 각각(표 1)의 5CV로 미리 충전된 음이온 교환 컬럼(1mL)을 평형화합니다. 모든 단계에서 1mL/분의 일정한 유속으로 음이온 교환 컬럼을 실행합니다.
   8. 음이온 교환 컬럼에 TOM-CC 피크 분획(단계 1.1.6)을 로드합니다(유속 1mL/분).
   9. 버퍼 B1의 5CV(표 1) 및 0%-20% 버퍼 B2(표 1)의 선형 염 구배로 컬럼을 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거합니다.
   10. 20%-35% 버퍼 B2의 선형 염 구배로 TOM-CC를 용리하고 280nm 크로마토그램에 나타나는 단백질 피크 분획을 수집합니다(그림 1C).
   11. SDS-PAGE로 시료 순도를 평가하고(그림 1D) 제조업체의 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정합니다( 재료 표 참조).
   12. 단백질 샘플을 액체 질소에서 동결하고 추가 사용이 있을 때까지 -80°C에서 보관합니다.
       주의 : 액체 질소는 환기가 잘 되는 곳에서 취급해야 합니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
        
2. OmpF의 분리
   1. LamB 및 OmpC³²가 결여된 대장균 균주 BE BL21(DE3) omp6을 멸균 조건 하에서 냉동 글리세롤 스톡에서 회수하고 Luria-Bertani(LB) 한천 플레이트에 연속으로 부착합니다(표 2). 이렇게하려면 샘플을 전체 플레이트에 골고루 펴십시오.
   2. 샘플을 한천에 5분 동안 담근 후 뚜껑을 닫은 상태에서 플레이트를 뒤집고 37°C에서 밤새 배양합니다.
   3. 단일 대장균 콜로니를 선택하고, 멸균 이쑤시개를 사용하여 이 단일 콜로니에 7.5mL의 LB 배지(표 2)를 접종하고, 37°C에서 교반(170rpm)하면서 밤새(14시간) 성장하도록 둡니다.
   4. 멸균 피펫이 있는 2 x 1 mL의 대장균 세포를 2 x 500 mL의 LB 배지로 옮기고(표 2), 진탕기에서 교반(~170 rpm)하면서 37°C에서 하룻밤(~14시간) 성장하도록 둡니다.
   5. 4°C에서 20분 동안 5,000 x g 에서 원심분리하여 세포를 수확하고, 펠릿을 액체 질소에서 동결하고, 추가 사용이 될 때까지 -80°C에서 저장한다.
      참고: 세포 펠릿의 습윤 중량은 일반적으로 배양 1L당 5g입니다. 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
   6. 세포(2g)를 20mL의 용해 완충액 C1(표 2)에서 해동 및 재현탁하고, 제조업체의 지침에 따라 최대 샘플 부피 35mL로 예냉식(4°C) 고압 세포 파괴 시스템을 통해 1,000psi에서 현탁액을 3회 통과시킵니다.
      주의 : 프렌치 프레스를 사용하면 심각한 부상을 입을 수 있습니다. 사용된 셀의 압력 한계를 초과하지 마십시오. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
   7. 4,000 x g 에서 15분 동안 원심분리하여 용해물로부터 깨지지 않은 세포를 제거하고, 상청액을 수집한다.
   8. 1시간 동안 100,000 x g 에서 초원심분리하여 멤브레인을 수집합니다.
   9. 멤브레인 펠릿을 10mL의 완충액 C2(표 2)에 재현탁하고 볼 베어링 유리 균질기를 사용하여 동일한 부피의 SDS 완충액 C3(표 2)과 혼합합니다.
      주의 : 완충액 C3의 β-메르캅토에탄올은 독성이 있습니다. 모든 관련 안전 규정을 따르십시오.
   10. 현탁액을 50°C의 수조에서 30분 동안 인큐베이션합니다.
   11. 시료를 100,000 x g , 20°C에서 1시간 동안 원심분리합니다.
   12. 멤브레인 펠릿을 볼 베어링 유리 균질기를 사용하여 10 mL의 SDS 완충액 C4(표 2)에 재현탁하고, 37°C의 수조에서 30분 동안 현탁액을 배양합니다.
       알림: 펠릿을 재현탁할 수 없는 경우 SDS 버퍼 C4를 최대 20mL 용량까지 추가합니다.
   13. 샘플을 20°C에서 100,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하고, 상층액을 수집한다.
   14. 상청액을 옥틸 폴리옥시에틸렌(옥틸 POE)과 최종 세제 농도 0.5%(w/v)로 혼합하고 샘플을 4°C에서 버퍼 C5(표 2)에 대해 24시간 동안 두 번 투석합니다. 이를 위해 제조업체의 지침에 따라 20kDa를 잘라낸 투석 튜브를 사용하고 s를 투석 튜브 또는 장치에 넣습니다.
       알림: 투석 튜브의 절단은 다른 분자량을 가진 단백질을 투석해야 합니다.
   15. SDS-PAGE로 샘플 순도를 평가하고 제조업체의 프로토콜(표 재료 표)에 따라 상업적으로 이용 가능한 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정합니다.
       참고: 95°C로 가열된 샘플은 단량체 OmpF를 나타냅니다. 가열되지 않은 샘플은 OmpF를 삼량체 형태로 보여줍니다(그림 1F).
   16. OmpF를 액체 질소 중 분취량으로 충격-동결하고, 추가 사용이 있을 때까지 -20°C에서 보관한다.
       주의 : 액체 질소는 환기가 잘 되는 곳에서 취급해야 합니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.

2. DIB 멤브레인에서 이온 채널의 광학 단일 채널 기록

참고: 이 섹션에서는 단일 이온 채널(¹⁷)을 통한 측면 단백질 이동 및 이온 플럭스를 모니터링하기 위해 미세 가공된 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 챔버(²)에서 DIB 멤브레인을 준비하는 절차를 설명합니다. 챔버 제조를 위한 치수 및 정확한 도면은 Lepthin et ^al.2에서 찾을 수 있습니다. 그림 2는 PMMA 챔버(²)의 조립 및 DIB 멤브레인의 형성에 대한 개요를 제공합니다. 달리 특정되지 않는 한, 모든 단계는 실온(RT)에서 수행된다. 그림 3은 DIB 멤브레인의 개략도를 보여주며, 단일 채널 단백질을 통한^Ca2+ 플럭스가 멤브레인에서의 움직임과 채널의 개방-폐쇄 상태 모두를 모니터링하는 데 어떻게 사용되는지를 보여줍니다.

1. 지질의 제조
   1. 클로로포름에 용해된 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(25mg/mL DPhPC)이 함유된 지질 원액을 -20°C의 냉동고에서 꺼내고 RT로 가온합니다. 이를 위해 일반적으로 샘플을 몇 분 동안 손으로 천천히 예열하는 것으로 충분합니다.
      주의 : 클로로포름은 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 흄 후드 아래에서 클로로포름과 관련된 모든 절차를 수행하십시오.
   2. 380μL의 DPhPC 원액(25mg/mL DPhPC)을 유리 바이알에 옮깁니다. 고무 밀봉이 있는 피펫을 피하십시오. 대신 스테인리스 스틸 플런저가 있는 마이크로리터 유리 주사기를 사용하십시오.
   3. 지질 원액을 취급한 후 지질 원액을 Ar 또는_N2 가스로 덮어 지질 산화를 방지한다. 지질이 용해된 유기 용매가 증발하거나 바이알에서 용매가 튀는 것을 방지하기 위해 가능한 가장 낮은 가스 흐름을 사용하십시오. 유기 용제가 함유된 지질이 들어 있는 유리 바이알의 뚜껑이 내부에 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)으로 코팅되어 있는지 확인하십시오.
   4. N2의 스트림 하에서 지질 샘플을 건조시키고(단계 2.1.2), 오일-프리 진공 펌프를 사용하여 진공(2.0 mbar) 하룻밤 동안 지질 샘플로부터 잔류 유기 용매를 제거한다.
   5. 마이크로리터 유리 주사기를 사용하여 동일한 부피의 헥사데칸과 실리콘 오일(각각 500μL)을 최종 지질 농도 9.5mg/mL에 추가하여 헥사데칸/실리콘 오일 용액에 지질 필름을 녹입니다.
      참고: 지질 용액은 RT에서 몇 주 동안 안정적입니다.
2. 아가로스 하이드로겔의 제조
   1. 이중 탈이온수에 약 1mL의 저융점 아가로스 용액(0.75%[w/v])을 준비하고 가열 블록에서 85°C로 20분 동안 가열하여 유리 커버슬립을 스핀 코팅하는 데 사용합니다.
      참고: 아가로스 용액은 RT에서 몇 주 동안 보관할 수 있으며 여러 번 재가열할 수 있습니다.
   2. 0.66M_CaCl2 및 8.8mM HEPES(pH 7.2) 중 저융점 2.5%(w/v) 아가로스 용액을 준비하고, 20분 동안 가열 블록에서 85°C로 가열합니다. 용설로오스가 잘 녹았는지 확인하십시오.
      참고: 아가로스 용액은 RT에서 몇 주 동안 보관할 수 있으며 스핀 코팅에 사용되는 아가로스(단계 2.2.1)와 마찬가지로 여러 번 재가열할 수 있습니다.
3. 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 챔버 어셈블리 및 하이드로겔 헥사데칸/실리콘 오일 계면에서 지질 단층 형성
   1. 유리 커버슬립(40mm x 24mm x 0.13mm)을 스테인리스 스틸 커버슬립 홀더에 넣고 초음파 세척기의 아세톤으로 유리 비커에서 10분 동안 청소합니다. 커버슬립을 물에 잠길 만큼만 아세톤을 사용하고 유리판으로 비커를 느슨하게 덮어 세척 과정에서 증기 누출을 최소화하는 무압력 폐쇄 시스템을 만듭니다.
      주의 : 아세톤은 인화점이 낮은 고인화성 용매입니다. 증기/공기 혼합물은 폭발성이 있습니다. 환기가 잘 되는 곳에서 초음파 세척기를 작동하십시오. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 공식 안전 예방 조치(예: 화염 및 스파크 금지)를 준수하십시오.
   2. 유리 커버 슬립을 이중 탈 이온수로 헹구고 N₂ 흐름에서 건조시킵니다.
      알림: 이러한 방식으로 청소한 커버슬립은 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.
   3. 플라즈마 클리너에서 커버슬립을 산소(0.5mbar)로 5분 동안 추가로 세척하고 친수성화합니다.
      참고: 플라즈마 세척의 친수성 효과는 시간이 지남에 따라 사라지므로 아가로스 용액으로 스핀 코팅하기 직전에 이 단계를 수행하십시오.
   4. 스핀 코터에 플라즈마 처리된 커버슬립을 장착합니다(그림 2, 1단계).
   5. 200μL 피펫을 사용하여 3,000rpm에서 30초 동안 가열된 0.75%(w/v) 저융점 아가로스(단계 2.2.1)의 140μL를 천천히 추가하여 커버슬립을 서브마이크로미터 두께의 아가로오스 필름으로 코팅합니다(그림 2, 1단계).
      주: 아가로스 필름의 두께는 기재된 바와 같이 원자력 현미경(AFM)에 의해 결정될 수 있다(^{도 17}).
   6. 아가로스 하이드로겔의 얇은 층이 있는 스핀 코팅된 커버슬립을 PMMA 챔버(²)의 밑면에 즉시 부착합니다. 아가로스 하이드로겔이 위쪽을 향하도록 합니다(그림 2, 2단계).
   7. 커버슬립의 가장자리를 투명 접착 테이프로 PMMA 미세 가공 장치에 고정합니다.
   8. 35°C로 가열된 핫플레이트에 PMMA 장치를 놓습니다(그림 2, 3단계).
   9. 스핀 코팅에 의해 적용된 얇은 하이드로겔이 2.5% 아가로스 용액의 완충액과 평형을 이루고 수화된 상태를 유지할 수 있도록 기포를 생성하지 않고 2.5% 아가로스 용액(단계 2.2.2)의 2.5% 아가로스 용액(단계 2.2.2)을 피펫으로 챔버의 입구에 조심스럽게 붓습니다. 2.5% 아가로스 용액이 스핀 코팅된 아가로스 하이드로겔 주위에 퍼지지만 그 위에 퍼지지 않도록 하며(그림 3A), PMMA 챔버를 가열판에 부드럽게 눌러 방지할 수 있습니다.
   10. PMMA 챔버의 웰(그림 2, 단계 4)을 총 60μL의 지질/오일 용액(단계 2.1.5)으로 즉시 덮어 아가로스-오일 계면에서 지질 단층 형성을 시작하고 PMMA 챔버의 웰에서 스핀 코팅된 아가로스의 탈수를 방지합니다. 장치를 35°C의 핫 플레이트에 약 2시간 동안 보관합니다.
       참고: PMMA 챔버의 원형 웰은 이전에 발표된 작업²에 따라 직경 0.5mm, 깊이 1.8mm입니다.
4. 헥사데칸/실리콘 오일 용액에 지질 코팅된 수성 액적의 제조
   1. 20μL의 지질 헥사데칸/실리콘 오일 용액(2.1.5단계)을 액적 배양 챔버의 여러 미세 가공 웰 각각에 놓습니다(그림 2, 4단계). 지질 헥사데칸/실리콘 오일 용액에 적합한 용기는 얇은 PMMA 플레이트²에 40mm x 30mm x 3.5mm의 작은 홈입니다.
   2. 수직 또는 수평 마이크로피펫 풀러(예: 패치 피펫 또는 날카로운 유리 전극 제조에 사용)를 사용하여 팁 개구부 직경이 20μm인 미세모세관 유리 바늘을 준비합니다. 7.5x에서 35x 사이의 줌 범위에서 저배율로 쌍안경 실체 현미경으로 미세모세관 유리 바늘의 개방 직경을 추정합니다.
      알림: 유리 모세관을 당기기 전의 예열 모드 설정, 당기기 가열 모드 및 견인력은 제조업체의 당김 장치 사양 및 모세관 유형에 따라 사전에 실험적으로 결정해야 합니다.
   3. 미세모세관 피펫 팁을 사용하여 8.8mM HEPES(pH 7.2), 7μM Fluo-8, 400μM EDTA, 1.32M KCl 및 30nM TOM 코어 복합체 또는 대안적으로 20nM OmpF를 포함하는 5μL의 수성 주사 용액으로 미세모세관 유리 바늘을 채웁니다. 다가 금속 이온(^Ca2+)이 결합하는 킬레이트 수지로 미리 처리된 이중 증류수만을 사용하여 주입액을 제조한다.
   4. 압전 구동 나노 인젝터에 수성 주입 용액과 함께 미세 모세관 유리 바늘을 장착합니다.
   5. 8.8 mM HEPES (pH 7.2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1.32 M KCl 및 30 nM TOM 코어 복합체 (단계 1.1.12)를 포함하는 100-200 nL의 수성 방울 (그림 2, 단계 4)을 나노 인젝터를 사용하여 지질 헥사 데칸 / 실리콘 오일 용액 (2.1.5 참조)으로 채워진 액적 배양 챔버의 웰에 주입합니다. 물방울을 웰에 몇 밀리미터(>10mm) 간격으로 배치하여 물방울이 서로 닿지 않도록 합니다. 그렇지 않으면 지질 단층이 오일/완충액 계면에서 아직 형성되지 않은 경우 더 큰 액적으로 병합됩니다.
      참고: 클래스 모세관과 나노인젝터를 사용할 수 없는 경우, 0.1 μL에서 0.5 μL 사이의 부피에 대해 단일 채널 마이크로리터 피펫을 사용하여 액적을 수동으로 준비할 수 있습니다(²). 그러나 이 경우 액적 부피가 정확하지 않습니다.
   6. 35°C로 가열된 핫 플레이트에서 PMMA 및 액적 배양 챔버(그림 2, 4단계)를 유지하여 액적/오일 계면에서 약 2시간 동안 지질 단층을 형성할 수 있습니다.
5. DIB 멤브레인에서 단일 이온 채널의 준비 및 이미징
   1. 10μL 일회용 폴리프로필렌 팁이 있는 단일 채널 마이크로리터 피펫을 사용하여 실체현미경으로 액적 배양 챔버의 웰에서 PMMA 챔버의 웰로 개별 수성 방울을 수동으로 옮깁니다(그림 2, 5단계). 액적이 하이드로겔-오일 계면에 형성된 지질 단층에 약 5분 동안 가라앉도록 하여 액적과 아가로스 하이드로겔 사이에 지질 이중층(그림 3)을 형성합니다.
   2. 도립 광학 현미경의 샘플 홀더에 DIB 멤브레인이 있는 PMMA 챔버를 장착하고 10x Hoffman 변조 대비 대물렌즈를 사용하여 멤브레인 형성을 평가합니다(그림 2, 6단계). DIB 막 형성은 액적과 하이드로겔 사이의 계면에서 투명한 흰색 고리로 표시됩니다(그림 4A). 파손된 DIB 멤브레인에는 이 링이 표시되지 않습니다(그림 4B).
      참고: 또는 DIB 멤브레인을 위상차 또는 미분 간섭 대비(DIC) 현미경으로 10배 배율로 시각화할 수 있습니다.
   3. DIB 멤브레인이 형성된 경우 EPIOORESCENCE 조명용 기존 광원, 488nm 레이저(Pmax = 100mW) 및 이면조사형 전자 증식 CCD 카메라(512 x 512픽셀>95% QE)가 장착된 TIRF 현미경(그림 2, 7단계)의 샘플 홀더에 PMMA 챔버를 장착하여 ~0.16μm의 픽셀 크기를 달성합니다.
   4. GFP 필터 세트를 사용하여 고강도 광원으로 에피형광 조명 아래에서 10x 배율 대물렌즈로 DIB 멤브레인의 가장자리를 초점을 맞춥니다.
   5. 100x/N.A. 1.49 아포크로닉 오일 TIRF 대물렌즈를 사용하여 고배율로 DIB 멤브레인의 동일한 가장자리를 미세 초점화하고, 다시 에피형광 조명 하에서 GFP 필터 세트를 사용하여 고강도 광원을 사용하여 액적에서 형광 염료 Fluo-8의 약한 배경 형광을 시각화할 수 있습니다(그림 4C).
   6. 필터 설정을 GFP에서 쿼드 밴드 TIRF 필터 세트로 변경합니다.
   7. 488nm 레이저를 켜고 대물 렌즈의 레이저 강도를 8mW에서 10mW 사이의 값으로 설정합니다.
      참고: 대물 렌즈의 레이저 강도에 대한 정량적 정보가 없는 경우가 많기 때문에 레이저 강도 설정은 제조업체의 사양에 따라 포토다이오드 센서가 장착된 광학 레이저 파워 미터를 사용하여 렌즈에서 별도로 측정하여 미리 보정해야 합니다.
      주의 : 레이저의 안전한 작동을 보장하기 위해 작업자는 레이저 방사선의 가능한 위험과 사고 예방 규정을 알고 있어야 합니다.
   8. 단일 이온 채널을 시각화하려면 TIRF 각도와 EMCCD 카메라 게인(예: EM 게인 배율기 설정: 285)을 조정하여 DIB 멤브레인의 개방 이온 채널이 어두운 배경에 고대비 형광 반점으로 나타나도록 하고(그림 4D-G), 육안으로 검사할 때 신호 대 배경 비율이 최대에 도달하도록 합니다. 단일 이온 채널을 통한 Ca²⁺-플럭스에 해당하는 스폿이 초점을 유지하고 중앙에서 강도가 높고 주변으로 갈수록 점차 감소하는 둥근 모양을 갖도록 합니다. 채널이 없는 멤브레인은 배경 형광만 표시합니다(그림 4C).
   9. 시간 경과에 따른 개별 채널의 움직임 및 개폐 활동을 기록하기 전에 형광 반점에 초점이 맞춰져 있는지 확인하여 이온 채널이 DIB 멤브레인으로 재구성되고 멤브레인 평면에서 측면으로 움직이는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 형광 분자가 멤브레인 근처의 레이저에 의해 생성된 소멸 필드 안팎으로 침지되고 있음을 나타낼 수 있습니다.
   10. 위치를 적절하게 추적하고 개별 이온 채널의 개방-폐쇄 상태를 모니터링할 수 있는 일련의 멤브레인 이미지를 기록합니다. 측면 이동도의 유형(예를 들어, 자유 운동 대 일시적인 앵커리지[참고를 위해,¹⁶ 참조]) 및 채널 활동의 상태(예를 들어, 개방 또는 폐쇄)를 결정하기 위해, 충분히 길고(예를 들어, 30초 내지 1분) 및 잘 샘플링된 궤적(예를 들어, 48초^-1의 프레임 속도)을 획득한다.
       참고: 채널링, 제한 또는 홉 확산(¹⁶ )의 관찰은 샘플링 속도가 제한된 경계 내에서 무제한 확산을 측정할 수 있을 만큼 충분히 빠를 것을 요구한다. 또한 데이터 샘플링 시간이 비제약 확산에서 제약 확산으로의 전환을 측정할 수 있을 만큼 충분히 긴지 확인합니다(자세한 내용은 Jacobson et ^al.16 참조).
6. 이미지 및 데이터 처리
   주: 상용 소프트웨어 패키지에 기초한 오픈 소스 이미지 프로세싱 패키지들(³³ ) 또는 자체-작성된 루틴들(¹⁷ )은 DIB들에서 개별적인 이온 채널들의 시공간 동역학을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 측면 멤브레인 이동성과 개별 채널을 통한 이온 플럭스의 상관관계를 파악하려면 필터 알고리즘을 적용해서는 안 됩니다.
   1. 전체 이미지의 평균 프레임 강도 를 에 피팅함으로써, 자체 기록 루틴을 사용하여 표준 절차(³⁴)를 적용함으로써 표백을 위한 이미지 시계열을 수정하고, 여기서 t는 프레임 인덱스(시간)이고 _ak는 피팅 파라미터이다. 그런 다음, 에 따라 시계열을 수정하며, 여기서 I(t)는 강도입니다. 대안적으로, 초기 데이터 분석을 위해, 롤링볼 알고리즘(³³) 및 롤링볼 반경을 갖는 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 배경 보정을 수행하고, 카메라의 스폿 및 픽셀 크기(예를 들어, 50 픽셀)에 의존한다.
   2. 정의된 관심 영역(ROI)(예를 들어, 30 x 30 픽셀) 내에서 형광 스폿의 공간적 위치 및 진폭을 결정하고, 주어진 시간 t에서 I(t)를 에 따라 가능한 국부 조명 구배를 설명하는 평면 기울기를 갖는 2차원 가우스 함수에 피팅한다. 여기서, x=(x,y)는 형광 강도 정보를 이용한 ROI이고, A와 σ는 가우시안의 진폭과 폭이며, _pk는 ROI의 배경 강도를 특징짓는 파라미터이며, μ=(x0,y0)는 가우시안의 위치를 정의한다. 개별 채널을 통과하는 이온 플럭스는 매개변수 A에 의해 제공됩니다. 채널의 궤적은 x로 주어지며 채널의 측면 이동성을 결정할 수 있습니다. 대안적으로, 설명된 바와 같이 오픈 소스 플랫폼⁽³³) 및 플러그인(^{35, 36})을 사용하여 개별 스폿의 위치 및 강도를 결정할 수 있다. EMCCD 카메라 판독값을 광자 수(³⁸)로 변환한 후 위치 정확도(³⁷)를 추정합니다.
   3. 형광 진폭 A 대 시간 및 해당 궤적 x를 플로팅하여 채널 확산도와 채널을 통과하는 이온 플럭스 사이의 가능한 상관 관계를 결정합니다. 모든 그래픽 소프트웨어에서 이 작업을 수행합니다. 자유 횡 채널 이동의 경우, 시간 지연 τ의 선형 회귀에 의해 횡방향 확산 계수 D를 결정하고, 에 따라 x로부터 스폿의 평균 제곱 변위를 계산한다.
      참고: DIB 멤브레인에서 자유롭게 이동하는 TOM-CC 및 OmpF에 대한 일반적인 확산 계수¹⁷ 은 0.5 내지 1.5 μm^{2 s-1} 범위이다. 확산 상수가 0.01 mm²·^s-1 미만인 분자는 고정화된 것으로 정의된다¹⁷.

실시간 무전극 광학 단일 채널 기록은 측면 단백질 이동과 DIB 멤브레인에서 개별 이온 채널의 기능 간의 상호 작용을 보여줍니다. 미토콘드리아 TOM 코어 복합체(도 1A)를 DIB 막(도 4D)으로 재구성한 것은 측면 이동성과 이온 투과성 사이의 강한 시간적 상관관계를 보여줍니다(도 5A). TOM-CC 게이팅은 횡방향 이동 모드(17)에 민감한 것으로 보인다. 움직이는 채널은 기공을 통해 Ca2+ 플럭스와 높은 형광점 강도를 보여줍니다. 갇힌 움직이지 않는 분자는 낮은 형광 강도와 중간 형광 강도를 나타냅니다. 미토콘드리아 TOM-CC의 일반적인 단백질 수입 공극의 경우, 이 단일 분자 접근법은 측면 이동성과 이온 투과성 사이에 강한 시간적 상관관계를 나타냈으며, 이는 TOM-CC 채널이 기계감응성을 가지고 있음을 시사한다17. 자유롭게 움직이는 TOM-CC 분자의 측면 정지는 TOM-CC 채널의 부분적 또는 완전한 폐쇄를 동반합니다. 멤브레인에 거의 완전히 내장된 OmpF(그림 1E 및 그림 4F)를 사용하여 DIB 멤브레인을 이미징하면 스톱 앤 고 효과가 나타나지 않습니다(그림 5B). OmpF의 무작위 정지는 강도의 변화와 관련이 없으므로 모공이 닫히는 것과 관련이 없습니다. 형광 신호들(38)에 기초하여, 개별 채널들의 위치 정확도는 5 내지 10 nm 사이의 범위에서 추정될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 120 nm의 평균 변위를 갖는 중간 상태의 TOM-CC 분자에 대해 도시된 바와 같이, 아가로스 하이드로겔을 사용한 이동 앵커링으로 인해 채널이 약간 흔들리는 경우에는 이러한 정확도를 달성할 수 없다는 점에 유의해야 한다(도 5A).

그림 1: TOM-CC의 분리. (A) N. crassa TOM-CC30,39의 Cryo EM 구조. 6xHis 태그가 있는 Tom22를 함유하는 N. crassa 균주의 미토콘드리아를 DDM에 가용화하고 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피(B) 및 음이온 교환 크로마토그래피(C)를 실시했습니다. (D) 분리된 TOM-CC의 SDS-PAGE. (E) 정제된 대장균 OmpF의 결정구조(PDB, 1OPF) 및 (F) SDS-PAGE. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: PMMA 챔버 어셈블리의 흐름도. 1단계: 유리 커버슬립을 아가로스 하이드로겔로 스핀 코팅합니다. 2단계: 스핀 코팅된 커버슬립을 맞춤형 PMMA 현미경 챔버에 장착합니다. 단계 3: 추가적인 저용융 아가로스를 35°C 열판 상의 PMMA 챔버의 입구 포트에 첨가한다. 4단계: 완충액/오일 계면(왼쪽)과 아가로스 하이드로겔/오일 계면(오른쪽)에서 수성 방울 주위에 지질 단층이 형성됩니다. 5단계: 개별 수성 방울을 PMMA 챔버의 웰에 피펫팅하여 두 개의 지질 단층이 접촉할 때 지질 이중층을 형성합니다. 6단계: DIB 멤브레인의 형성은 Hofmann 변조 조영 현미경으로 검증됩니다. 7단계: 이온 채널이 삽입된 DIB 멤브레인의 선택된 영역의 이미지를 TIRF 현미경으로 획득합니다. 녹색: 0.75% 아가로스; 황색:Ca2+ 이온을 함유하는 2.5% 아가로스; 마젠타: 지질/유상; 진한 파란색: Ca2+ 민감성 염료 및 단백질을 함유한 수성 액적 완충액. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 실험 설정. (A) PMMA 웰에 있는 DIB 멤브레인의 개략도. 이중층은 트랜스에서Ca2+-민감성 형광 염료(Fluo-8)를 사용하여 시간 경과에 따라 이온 채널을 통해 Ca2+-플럭스의 TIRF 이미징을 허용하기 위해 초박형 0.75% 아가로스 필름 위에 놓여 있습니다. (B) Ca2+-플럭스는 cis에서 trans까지의 삼투압에 의해서만 제어됩니다. 이를 통해 멤브레인의 위치와 채널의 개방 폐쇄 상태를 모두 결정할 수 있습니다. 여기에 표시된 채널은 N. crassa 미토콘드리아30의 단백질 전도성 채널 TOM-CC입니다. (C) 단일 TOM-CC 채널의 궤적. 녹색: 움직이는 채널; 노란색: 움직이지 않는 채널. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: DIB 멤브레인에서 TOM-CC 및 OmpF 이미징. (A) 하이드로겔과 액적 사이의 이중층 접촉 면적을 보여주는 Hoffmann 변조 대조 현미경으로 이미지화된 DIB 멤브레인. (B) (A)와 같이 이미징된 파손된 DIB 멤브레인. 화살표, PMMA 챔버의 가장자리. (C) 단백질 채널 없이 TIRF 현미경으로 이미지화한 DIB 멤브레인. (D) TIRF 현미경으로 이미지화한 재구성 TOM-CC가 있는 DIB 멤브레인. 흰색 사각형은 높음(SH), 중간(S I) 및 낮음(SL) 강도의 반점을 표시합니다. (E) (A)에 표시된 3개 지점의 형광 강도 프로파일을 2차원 가우스 함수에 맞추면 개별 TOM-CC의 위치와 채널을 통한Ca2+ 플럭스가 나타납니다. (F) 재구성된 OmpF가 있는 DIB 멤브레인. (G) (F)에 표시된 형광 스폿의 가우스 피팅. 2 기공 β 배럴 단백질 복합체 TOM-CC와 달리 3 기공 β 배럴 OmpF는 단 하나의 투과성 상태를 나타냅니다. 픽셀 크기, 0.16μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 채널 활동은 TOM-CC의 측면 이동도와 상관관계가 있습니다. (A) TOM-CC의 형광 진폭 트레이스(위)와 해당 궤적(아래)은 TOM-CC의 개방-폐쇄 채널 활성이 복합체의 측면 막 이동도와 상관관계가 있음을 나타냅니다. 궤적에는 세 가지 투과성 상태가 표시됩니다. 녹색: 완전히 열린 상태; 노란색 : 중간 투과성 상태; 빨간색: 닫힌 채널 상태; 붉은 별: 중간 상태의 TOM-CC는 평균 위치에서 약 ±60nm 정도 흔들립니다. 완전 개방 및 중간 상태에서의 형광 신호에 기초한 위치 정확도(37)는 5 nm 내지 10 nm 사이의 범위이다. (B) OmpF의 형광 진폭 트레이스(위) 및 해당 궤적(아래). OmpF는 이동 중인지 갇혀 있는지에 관계없이 하나의 강도 수준만 나타냅니다. 갇힌 분자의 기간에 해당하는 궤적 세그먼트는 회색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: TOM-CC 분리를 위한 버퍼 솔루션.

표 2: OmpF 분리를 위한 버퍼 용액.

우리는 이해 상충을 선언하지 않습니다.