전체 중추 및 말초 신경계 마우스 해부

요약

여기에서는 마우스의 중추 및 말초 신경계의 해부를 완료하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 절개된 조직은 전체 사진 촬영 또는 조직학과 같은 다운스트림 응용 분야에서 추가로 분석됩니다.

초록

동물 모델은 신경 과학 분야의 주력 분야를 대표합니다. 그럼에도 불구하고 오늘날에는 완전한 설치류 신경계를 해부하기 위한 단계별 프로토콜이 아직 없으며 무료로 사용할 수 있는 완전한 회로도도 없습니다. 뇌, 척수, 특정 등뿌리 신경절 및 좌골 신경(별도로)을 채취하는 방법만 사용할 수 있습니다. 여기에서는 중추 및 말초 쥐 신경계에 대한 자세한 그림과 개략도를 제공합니다. 더 중요한 것은 해부를 수행하기 위한 강력한 절차를 간략하게 설명하는 것입니다. 30분 사전 해부 단계를 통해 내장과 피부가 없는 근육으로 척추 내의 온전한 신경계를 분리할 수 있습니다. 그 후 2-4시간 동안 미세 해부 현미경으로 척수와 흉부 신경을 노출시키고 최종적으로 사체에서 중추 및 말초 신경계 전체를 벗겨냅니다. 이 프로토콜은 전 세계적으로 신경계의 해부학 및 병태생리학을 연구하는 데 있어 중요한 진전을 나타냅니다. 예를 들어, 신경섬유종증 I형 마우스 모델에서 절개된 배근 신경절은 종양 진행의 변화를 밝히기 위해 조직학을 위해 추가로 처리될 수 있습니다.

서론

이 방법의 전반적인 목표는 마우스의 중추 신경계와 말초 신경계를 한 조각으로 분리하는 것입니다. 현재 설치류의 신경계 전체를 해부하여 전 세계적인 수준으로 연구할 수 있는 프로토콜은 없습니다. 신경과학자들은 전형적으로 좌골 신경을 말초 신경¹의 대리물로 사용하고, L3 내지 L5 신경절2을 모든 신경절의 대리 신경절로 사용합니다. 이러한 방법을 사용하면 결과가 특정 신경/신경절에 특이적인지 결론을 내릴 수 없습니다. 적어도 일부 신경 병리학이 모든 신경과 신경절에 동등하게 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있기 때문에 ^3,4,5 설치류 신경계 전체를 분리할 수 있는 기술을 개발하여 전 세계적으로 연구해야 합니다.

수년에 걸쳐 우리는 생쥐의 완전한 중추 및 말초 신경계를 해부하는 방법을 개발하고 개선했습니다. 첫 번째 단계는 본질적으로 해부 현미경 하에서 미세 해부 단계를 준비하기 위해 마우스의 전체 해부입니다. 2단계부터 4단계까지는 척수와 흉부 신경을 노출시키고 뇌를 절개한 후 척수와 말초 신경 전체를 사체에서 벗겨냅니다.

이 방법은 거시적 또는 미시적 변화를 문서화하기 위해 이미징 또는 조직학과 결합할 때 강력합니다 6,7,8,9. 전 지구적 변화를 조사하거나 가설에 기반하지 않는 실험을 수행하는 데 관심이 있는 신경과학자들은 이 방법을 사용하여 전 세계 신경계를 조사해야 합니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 프로토콜은 캐나다 동물 관리 인증 기관에 대한 위원회인 Comité Institutionnel des Animaux de l'Université de Sherbrooke의 승인을 받았습니다.

1. 미세박리(micro-dissection) 준비(해부 전)

1. 5% 이소플루란으로 마취를 수행한 후 활력 징후가 없을 때까지 2% 이소플루란과 10psi의 CO₂ 로 안락사를 수행합니다.
   참고: 경추 탈구는 척수와 경추 신경절에 손상을 주므로 경추 탈구를 수행하지 마십시오.
2. 안락사된 쥐를 해부 패드에 위를 향하게(앞쪽 view) 놓고 털에 70% 에탄올을 뿌립니다.
3. 그런 다음 4개의 작은 직경의 핀을 사용하여 위쪽과 아래쪽 팔다리를 고정하여 해부하는 동안 마우스를 제자리에 고정합니다.
4. 수술용 가위를 사용하여 하복부에서 목구멍까지 피부를 잘라냅니다.
5. 피부를 벗겨 내부 장기를 노출시키고 추가 핀을 사용하여 복강을 노출시키면서 양쪽의 피부를 유지합니다.
6. 흉곽을 잘라 심장과 폐를 노출시킵니다.
7. 한 쌍의 표준 해부학적 집게를 사용하여 식도와 기관을 잡고 집게 바로 위를 자릅니다.
8. 그런 다음 두개골에서 꼬리로 접근하여 모든 내부 장기를 벗기기 시작합니다. 이렇게 하려면 척추를 따라 횡격막을 잘라 모든 내부 장기를 한 조각으로 제거합니다.
9. 마우스의 핀을 풀고 싱크대에서 복강에 있는 여분의 마우스 혈액을 헹굽니다.
10. 마우스를 아래로 향하게 놓습니다(후방 보기). 해부하는 동안 4개의 핀을 사용하여 마우스를 제자리에 고정하여 위쪽 팔다리와 아래쪽 팔다리를 고정합니다.
11. 수술용 가위를 사용하여 머리부터 뒷다리까지 피부를 벗겨냅니다.
12. 왼쪽 좌골 신경(하지 신경)을 노출시킵니다.
    1. 왼쪽 하지 아랫부분의 근육을 잘라냅니다.
    2. 좌골 신경을 찾아 주변 근육을 제거하여 노출시킵니다.
    3. 경골신경, 경골신경, 비골신경의 좌골신경을 조심스럽게 절단하고 혈관을 살려낸다.
    4. 표준 해부학적 겸자와 매우 미세한 본 가위를 사용하여 척추와 평행이 되어 약 2cm의 자유 신경이 남을 때까지 좌골 신경을 계속 분리합니다.
    5. 수술용 가위를 척수와 평행하게 삽입하고 엉덩이를 자릅니다.
    6. 손가락을 사용하여 천골과 대퇴골을 잡아당겨 고관절을 탈구합니다.
       참고: 이 과정에서 중단을 피하기 위해 집게를 사용하여 좌골 신경을 부드럽게 당기기 위해 자주 멈춰야 합니다.
    7. 마지막에 쥐 사체에서 뒷다리를 섬세하게 떼어내면 약 4cm 길이의 좌골 신경이 남습니다.
       참고: 이 과정에서 L2 신경을 찾아 뒷다리에서 빼내어 L2의 손상을 방지하십시오. 오른쪽에 대해 1.12단계를 반복합니다.
13. 상완 신경(상지)을 노출시킵니다.
    1. 쥐 사체를 평평한 표면(해부 패드)이 아닌 손으로 조작하십시오.
    2. 왼쪽 겨드랑이의 지방과 근육을 떼어내어 왼쪽 상완신경총을 찾습니다.
    3. 일단 위치를 찾으면 주요 상완신경총 파급효과(방사상, 겨드랑이, 견골상)와 척골 주위의 하위 파급효과를 매우 가는 본 가위로 자르고 약 1.5cm의 여유신경을 남겨둡니다. 왼쪽 상지에서 신경총을 부드럽게 떼어냅니다.
    4. 왼쪽 상단 팔다리를 탈구하십시오. 신경이 쓰이지 않는지 확인하십시오. 오른쪽에 대해 1.13단계를 반복합니다.
14. 뇌를 드러내십시오.
    1. 이제 마우스를 위로 향하게 놓습니다(앞쪽 보기).
    2. 아주 가는 본 가위의 칼날 하나를 입에 넣고 목구멍을 통해 하악골을 자릅니다.
    3. 뺨에서 목구멍까지 더 잘라 하악골을 제거합니다.
    4. 그런 다음 한쪽 귀에서 다른 쪽 귀로 가는 두개골 뼈를 자릅니다.
       알림: 너무 깊숙이 들어가 뇌가 손상되지 않도록 주의하십시오.
    5. 입천장과 코뼈를 잘라 제거하여 두개골을 엽니다.
    6. 두개골 기저부의 C1 척추뼈를 잘라 소뇌와 척수의 시작 부분을 분리합니다.
    7. 마지막으로 두개골을 눈까지 가로로 자르고 두개골 조각을 제거하여 뇌를 노출시킵니다.
       참고: 신경이 벗겨질 때까지 뇌를 구멍 안에 두십시오.
15. 시체에서 여분의 지방이나 근육을 제거하십시오. 지육을 10% 포르말린에 넣고 실온(RT)에서 15분 동안 두었다가 고착성 냄새가 더 이상 없을 때까지 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 간단히 세척한 후 다음 단계로 진행합니다.
    참고: 앞으로 2주 이내에 신경계를 절개하면 PBS에서 4°C로 보관하십시오. 그렇지 않으면 10% 포르말린에 무기한 보관하십시오. 포르말린을 조작할 때는 항상 화학 후드를 사용하십시오.

2. 척수 노출

1. 척수를 노출시키려면 두개골에서 꼬리로 가는 방법을 사용하십시오. 각 척추뼈와 그 위의 근육층을 제거하려면 Vannas 스프링 가위를 사용하여 복부 쪽의 10시와 2시 위치에서 자릅니다. Dumont 미니 집게를 사용하여 척추를 깎아냅니다. 경추와 흉추를 통해 이 과정을 계속하십시오.
2. 요추 부분의 경우 척추의 각 측면에서 횡돌기를 자릅니다. 그런 다음 Vannas 스프링 가위의 날을 척추관에 삽입하여 2시와 10시 위치에서 자릅니다. 조직을 제거하고 때때로 뼈에 붙어있는 신경에주의를 기울입니다.
3. 꼬리 부분도 마찬가지로 진행합니다.

3. 흉부 신경 노출

1. 사체를 해부 현미경 아래에 놓고 앞쪽을 시각화합니다.
2. Vannas 스프링 가위를 사용하여 각 갈비뼈(흉골에서 하지까지)를 따라 잘라 말초 신경을 노출시킵니다.
3. 다음으로, 신경절의 양쪽(측면)에 있는 척추뼈를 잘라 신경절이 드러나게 합니다.

4. 말초 신경 박리

1. 척수를 제거하고 말초 신경을 더 멀리 빼내려면 Dumont 미니 집게를 사용하여 척수를 부드럽게 굴리고 척수의 꼬리 부분부터 시작하여 신경을 하나씩 뽑아냅니다.
   알림: 벗기기 전에 RT에서 15분 동안 10% 포르말린으로 추가 고정을 수행한 다음 1.15단계에서 수행한 것처럼 더 이상 고정 냄새가 없을 때까지 짧은 1x PBS 세척을 수행할 수 있습니다.
2. 흉부 부분의 경우 신경을 90° 각도(척수에 수직)로 당깁니다.
3. 상완신경총의 경우 신경 옆에 있는 척추를 잘라 신경을 위한 공간을 만듭니다.
   참고: 상완신경총은 흉부 영역에서와 같이 척추 아래를 통과할 수 없습니다.
4. 신경을 맑게 하기 위해 여분의 근육을 제거하십시오.
5. 4°C의 PBS에서 최대 총 2주 동안 보관하거나 RT에서 10% 포르말린에 무기한 보관하십시오.

결과

설치류는 신경계 생물학과 병태생리학에 대한 우리의 이해에 중요한 역할을 해왔다¹⁰. 흥미롭게도, 실시간 모델 ^1,2,11에서 해부학적 및 병리학적 변이를 평가하기 위해 설치류의 중추 및 말초 신경계를 완전히 해부하는 방법은 없습니다. 그림 1은 1단계부터 4단계(미세박리, 척수 노출, 흉추 신경 노출 및 말초 신경 박리를 위한 준비)에 대한 개요를 보여줍니다. 1단계에서는 내장을 모두 제거하고, 피부를 벗겨내고, 주신경총(상완천골과 요추)을 팔다리에서 빼냅니다. 2단계와 3단계에서는 척추뼈를 부분적으로 제거하여(복부) 척수를 노출시킵니다. 4단계에서는 전체 신경계가 쥐 사체로부터 분리됩니다. 전체적으로 절차를 완료하는 데 2.5-5시간이 걸립니다.

토론

근육과 신경이 건조해지는 것을 방지하기 위해 10분마다 사체를 PBS에 담가야 합니다. 하지 탈구를 할 때(단계 1.12.6), 좌골 신경총과 L2를 손상/찢어지지 않도록 항상 시야에 두는 것이 중요합니다. 뇌를 해부할 때(단계 1.14.4), 뇌를 손상시키지 않도록 너무 깊이 들어가지 않는 것이 중요합니다. 일반적으로 등뿌리 신경절과 말초 신경을 절개할 때, 신경 구조의 손상을 방지하기 위해 손상되지 않은 고품질의 Dumont 미니 집게를 사용하는 것이 중요합니다.

15분 10% 포르말린 고정 단계 대신, Chen et ^al.5에서와 같이 4% 파라포름알데히드 관류가 실행 가능한 대안입니다. 쥐의 신경계의 특정 부분(즉, 상완신경총)에만 관심이 있다고 가정해 보겠습니다. 이 경우 다른 부분(즉, 흉추, 요추 및 천골)에서 절개를 생략하여 프로토콜을 조정할 수 있습니다. 훨씬 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dumont 미니 집게	Fine Science Tools	#11200-10
Extra Bonn 가위	Fine Science Tools	#14084-08
포르말린 10%	Fischer Scientific	#22-046-361
PBS 1x	BioShopCanada	#PBS404.500
표준 해부학 집게	Fine Science Tools	#91100-12
외과 용 가위	Fine Science Tools	# 140001-12
Vannas 스프링 가위	Kent Scientific	#INS600124