방법 논문

단백질 고차원 구조 분석을 위한 질량 분석 기반 접근법

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DOI:

10.3791/64979

⸱

2023년 3월 3일

 , 
1Biologics Development, Bristol Myers Squibb, 2Eli Lilly and Company

이 논문에서

초록

논의 된 기사 :

Espino, JA, 존스, LM Caenorhabditis elegans의 단백질 상호 작용 연구를 위한 생체 내 하이드록실 라디칼 단백질 발자국. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (158), e60910 (2020).

Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. 단백질의 세포 내 빠른 광화학적 산화로 세포 단백질을 특성화. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (157), e60911 (2020).

Moorthy, BS, Iyer, L. K., Topp, E. M. 동결 건조 분말의 단백질 구조 및 상호 작용을 연구하는 질량 분석 접근 방식. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (98), e52503 (2015).

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. 펩타이드 생합성 효소를 조사하기 위한 수소-중수소 교환 질량 분석법(HDX-MS) 플랫폼입니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (159), e61053 (2020).

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. 질량 분석법에 의한 단백질 고차 구조 연구를 위한 디에틸피로카보네이트를 사용한 공유 라벨링. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (172), e61983 (2021).

Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, JA, Gershenson, A., Jones, L. M. 이동식 XY 스테이지가 있는 플랫폼 인큐베이터: 단백질의 세포 내 빠른 광화학적 산화를 구현하기 위한 새로운 플랫폼. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (171), e62153 (2021).

Haupt, C. et al. 다중 소단위 단백질 어셈블리의 아키텍처를 연구하기 위해 온전한 단백질 복합체의 화학적 가교 결합 및 질량 분석법을 결합합니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (129), e56747 (2017).

Lento, C. et al. 단백질 구조 및 역학 연구를 위한 시간 분해 전기 분무 이온화 수소-중수소 교환 질량 분석법. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (122), e55464 (2017).

Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. 단백질의 고차 구조 분석을 수행하기 위한 레이저가 없는 하이드록실 라디칼 단백질 발자국. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (172), e61861 (2021).

Misra, S. K., Sharp, J. S. 단백질 지형 변화 측정을 위해 단백질의 빠른 광화학적 산화에서 실시간 보상을 가능하게 합니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (163), e61580 (2020).

Chaihu, L. et al. 하향식 질량 분석법으로 단백질의 구조적 특성화를 위한 모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (172), e62672 (2021).

사설

고차 구조(HOS)는 단백질 기능과 밀접한 관련이 있기 때문에 단백질 특성화의 중요한 측면입니다. 질량 분석법(MS)은 단백질 HOS1을 평가하는 주요 방법 중 하나입니다. MS 기반 접근법은 원자 분해능으로 단백질 구조를 분해할 수는 없지만 중간 및 높은 공간 분해능, 높은 특이성, 낮은 샘플량 요구 사항, 높은 처리량 및 단백질체학 기능의 장점이 있습니다.

MS 기반 단백질 발자국 접근법은 단백질의 용매 접근 표면을 분석하여 단백질 HOS를 평가하며 일반적으로 다양한 화학 라벨링 접근법과 결합됩니다. 수소-중수소 교환(HDX)과 같은 가역적 표지는 단백질 1,2의 백본 아미드 수소를 표적으로 합니다. 비가역적 표지는 특정 아미노산 잔기를 표적으로 하는 화학물질 3 또는 더 높은 반응 속도로 다양한 잔기를 표지하는 라디칼을 사용합니다1. 화학적 가교도 비가역적 표지 범주의 일부이지만, 2가 특징을 통해 두 개의 가교 부위 사이의 공간적 제약을 결정할 수 있어 고유한 위상학적 통찰력을 제공합니다 4,5. 이러한 모든 접근 방식을 결합하여 "도구 상자"를 형성할 수 있으므로 MS는 단백질 HOS를 밝히는 데 유용한 도구가 됩니다.

우리는 MS 기반 단백질 HOS 분석 분야의 최근 발전을 제시하기 위해 이 방법 모음을 구성했습니다. 첫 번째 문서 세트에는 HDX 기반 접근 방식이 포함되어 있습니다. Habibi와 Thibodeaux6 은 비교적 고전적인 연속적인 상향식 HDX-MS 접근법을 설명합니다. 여러 번의 교환 시간에 용액 내 수소-중수소(H/D) 교환 후 온컬럼 펩신 분해를 통해 펩타이드 수준에서 중수소 흡수 수준을 결정할 수 있습니다. 차등 실험(즉, 결합 상태 대 결합되지 않은 상태)을 수행할 때 중수소 흡수 수준이 증가하거나 감소하는 펩타이드는 HOS에서 변화를 경험하는 영역을 나타냅니다. 저자는 란티펩티드 합성효소를 사용하여 HDX-MS 워크플로우를 훌륭하게 보여줍니다.

상향식 접근 방식 외에도 HDX-MS는 하향식 방식으로 수행할 수 있으므로 분석가는 온전한 단백질 수준에서 다양한 분리 전략을 적용할 수 있습니다. Chaihu et al.7 은 모세관 전기영동을 활용하여 용액에 공존하는 서로 다른 단백질 상태 또는 프로테오폼을 분리합니다. 단백질은 중수소화 배경 전해질 용액의 모세관에서 이동하는 동안 전기영동 중에 H/D 교환을 거치며, 그 후 하향식 MS 분석 및 기상 단편화를 통해 전체 및 단편 수준 모두에서 중수소 흡수 수준을 평가합니다. 마지막으로, 이 컬렉션에는 H/D 교환의 다양한 방법을 강조하는 두 가지 다른 방법, 즉 동결건조 전력8 교환과 전기 분무 이온화9 후 교환이 있습니다.

두 번째 기사 그룹은 비가역적 라벨링 방법을 다룹니다. 그 중 단백질의 빠른 광화학적 산화(FPOP)는 단백질 표면을 표시하기 위해 라디칼을 표지 종으로 활용합니다10,11. 실제로 과산화수소는 레이저를 통해 광활성화되어 활성 표지 종 역할을 하는 수산기 라디칼을 생성합니다. Misra와 Sharp12는 아데닌을 라디칼 농도에 대한 리포터로 사용하고 인라인 라디칼 선량 측정 시스템을 사용하여 아데닌 반응을 모니터링하는 라디칼 선량 측정 전략을 제시합니다. 이를 통해 하이드록실 라디칼 농도를 실시간으로 보상할 수 있으며, 따라서 반응 조건을 정규화하여 정확한 판독을 제공할 수 있습니다. 그 후 Weinberger와 Chea는 Sharp 그룹과 협력하여 레이저가 없는 FPOP 플랫폼13을 개발했습니다. 유해 레이저를 플라즈마 광원으로 대체하고 이를 인라인 라디칼 선량 측정 및 자동 샘플 수집 시스템과 결합하여 단백질 HOS를 특성화해야 하는 연구자를 위한 통합 솔루션을 개발 및 제공합니다.

Jones의 그룹 14,15,16의 세 가지 기사는 FPOP와 단백질 발자국을 생체 내 연구에 도입할 가능성을 탐구합니다. 이 접근 방식의 장점은 단백질 HOS를 기본 환경에서 분석할 수 있다는 점에서 전례가 없습니다. 세포14 및 Caenorhabditis elegans15에서 발자국의 성공적인 적용은 천연 상태에서 전체 프로테옴의 HOS를 추적할 수 있는 새로운 가능성을 열어 다른 도구를 통해 달성할 수 없는 단백질 HOS에 대한 깊은 이해를 가능하게 합니다.

비가역적 라벨링의 또 다른 중요한 방법은 특정 아미노산 잔기를 표적으로 하는 화학 시약을 활용합니다3. Kirsch et al.17 은 공유 라벨링을 통해 단백질 발자국의 잘 활용된 워크플로를 보고합니다. 저자는 디에틸피로카보네이트를 표지 시약으로 사용하여 단백질 표면에 몇 가지 종류의 아미노산 잔기를 표지하여 단백질 HOS의 변화를 조사합니다. 차등 실험에 이어 단백질 분해 분해 및 상향식 MS 분석을 통해 워크플로우를 통해 HOS의 변화와 직접적으로 관련된 용매 접근성의 변화를 식별할 수 있습니다.

마지막으로, 화학적 가교는 2가 화학 시약을 활용하여 단백질을 표지하는 또 다른 중요한 접근 방식입니다 4,5. 화학적 가교제는 공간적으로 서로 가깝고 종종 구조적 복합체를 형성하는 두 단백질을 가교하는 데 사용됩니다. Haupt et al.18은 단백질 복합체의 구조를 이해하기 위해 화학적 가교제의 사용을 보여주는 프로토콜을 보고합니다. 가교 단백질 복합체는 두 가지 다른 수준에서 분석할 수 있습니다. 단백질 분해 분해 후 MS 식별을 통해 가교 디펩타이드는 단백질 복합체의 상호 작용 부위를 드러냅니다. 온전한 질량을 통해 가교 샘플을 분석할 때 복합체 내의 단백질 서브유닛에 대한 화학량론적 정보를 쉽게 사용할 수 있습니다.

요약하자면, 우리는 지난 30년 동안 단백질 HOS 분석을 위한 MS 기반 도구의 상당한 발전을 목격했습니다. MS 분석과 결합된 비가가적 및 가역적 발자국은 서로를 보완하며 함께 단백질 HOS 특성 분석에 크게 기여합니다. 이 방법 컬렉션에 포함된 작업은 MS 기반 단백질 HOS 분석 분야의 예술 방법을 나타냅니다. 이러한 연구는 중요한 질문에 답하기 위해 MS 기반 접근 방식을 활용하려는 연구자에게 귀중한 리소스입니다. 더 넓은 관점에서 볼 때, 발자국 데이터를 구조 예측에 통합하는 것은 MS 기반 방법에서 공간 해상도의 한계를 깨는 데 매우 중요합니다. 그러한 접근 방식의 타당성을 보여주는 선구적인 작업이 존재합니다19,20. 또한 이러한 접근 방식은 서로를 보완하고 다양한 관점에서 통찰력을 제공하기 때문에 플랫폼 통합도 중요합니다21,22. 이 컬렉션에 보고된 방법은 이러한 통합의 힘을 보여주며 이러한 방향으로 지속적으로 개발될 것입니다. 이러한 모든 발전으로 MS 기반 접근 방식은 분자량 측정을 넘어 성장했으며 향후 수십 년 동안 이 분야에서 지속적인 성장을 보일 것입니다.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 감사의 말을 전하지 않습니다.

참고문헌

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