방법 논문

생체 분자 상호 작용 연구를 위한 형광 기반 방법

2024년 2월 23일

1Interdisciplinary Institute for Neurosciences (IINS), CNRS UMR5297, University of Bordeaux

이 논문에서

초록

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논의 된 기사 :

Reiser, A., Woschée, D., Kempe, S. M., Rädler, J. O. 단일 세포 어레이의 생세포 이미징(LISCA) - 세포 동역학을 정량화하는 다목적 기술. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (169), e62025 (2021).

Konate, K., Seisel, Q., Vivès, E., Boisguérin, P., Deshayes, S. 세포 침투 펩타이드에 의한 막 불안정화를 조사하기 위한 형광 누출 분석. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (166), e62028 (2020).

Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, M., Drin, G. 멤브레인 간 포스파티딜세린/포스파티딜이노시톨 4-인산염 교환의 형광 기반 측정. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (169), e62177 (2021).

Abdelhamid, M. A. S., Rhind-Tutt, A. V., Ambrose, B., Craggs, T. D. 오픈 소스 smfBox를 사용하여 정밀하고 정확한 단일 분자 FRET 측정. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (173), e62378 (2021).

사설

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생체분자 상호 작용은 생물학적 과정의 핵심 역할을 하므로 생명 과학의 근본적으로 중요한 측면입니다. 형광 기술은 이러한 과정을 조사하고 이해하는 데 가장 강력하고 널리 적용되는 방법 중 하나가 되었습니다. 시험관 내 형광 접근법은 세포외 및 세포내 분자 상호 작용을 실시간으로 검출할 수 있는 잠재력을 제공하며, 이는 다른 접근 방식에 비해 큰 이점을 구성합니다. 이것은 다양한 단백질-단백질, 단백질-핵산 및 단백질-막 상호 작용에 사용되어 왔으며, 이는 세포 과정의 조절에 중요한 역할을 합니다.

이 컬렉션은 생체 분자 상호 작용 연구를 위한 다양한 형광 기반 기술 및 응용 프로그램에 대한 개요를 제공하고 세포 과정에 대한 이해를 넓힙니다.

Reiser et al.1 은 자동화된 이미지 획득 및 처리(Live Cell Imaging on Single Cell Arrays[LISCA]) 를 통해 개별 세포의 세포 동역학을 분석하기 위한 고처리량 방법을 설명합니다. 이 기술을 사용하여 형광 리포터는 형질감염 후 단일 세포 유전자 발현, 신호 전달 캐스케이드의 세포 반응, 세포사멸 사건 또는 줄기 세포 분화와 같은 다양한 독립적인 생물학적 과정에 대한 시간 분해 판독값을 제공합니다. 저자는 주사 타임랩스 현미경을 사용하여 분리된 세포 어레이에서 이미징을 수행하여 수백 개의 단일 세포 궤적과 통계 분석을 위한 충분한 데이터를 얻습니다. 단일 세포 형광 시간 추적은 연구자들이 유전자 전달 메커니즘을 더 잘 이해하고 일반적으로 고유한 변동에 의해 결정되는 복잡한 생물학적 시스템의 특징인 세포 이질성을 해결하는 데 도움이 될 것입니다.

Konate et al.2 은 막 상호 작용 펩타이드의 상호 작용, 섭동 및/또는 투과화를 특성화하는 생물물리학적 방법을 보고합니다. 그들의 프로토콜에서 그들은 리포좀을 제형 및 정제하고 형광 누출을 특성화하는 다양한 단계를 정확하게 설명합니다. 이 방법은 작은 간섭 RNA(siRNA)와 결합하거나 강력한 치료 펩타이드(iCAL36)와 결합하여 WRAP이라는 세포 침투 펩타이드(CPP)와 함께 적용되며 잘 알려진 CPP인 페퍼라틴과 비교됩니다. 이 기술은 여러 가지 이점을 제공합니다. 빠르고 간단하게 구현할 수 있습니다. 이를 통해 지질막 구성을 엄격하게 제어하여 다양한 유형의 세포막을 모방할 수 있습니다. 형광단은 관심 펩타이드와 막 누출 특성에 따라 조정될 수 있습니다. 마지막으로 샘플은 준비 후 매우 안정적입니다. 이 기술의 다양성은 세포 손상 또는 약물 전달에 관한 다양한 생물학적 질문을 조사하는 데 유용한 접근 방식을 만듭니다.

포유류 세포막에서 포스파티딜세린(PS)의 존재는 세포 세포사멸과 같은 다양한 신호 전달 과정이나 막 복구를 위한 단백질 모집에서 중요합니다. 원형질막 표면에서 PS 분포의 전달 및 변화는 Ikhlef et al.3 이 논문에서 다루는 핵심 질문입니다. 그들은 재조합 효모 단백질 Osh6p에 의한 PS 및 PI-4-P 지질 수송 및 교환을 실시간으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 형광 센서를 활용하여 지질 전달 단백질(LTP)이 지질 소포 사이의 기울기를 따라 인공 막에서 지질을 추출하거나 전달하는지 여부를 감지합니다. 이 프로토콜을 사용하면 표지되지 않은 지질로 작업하여 LTP에 지질을 올바르게 결합할 수 있습니다. 또한 방사능 기반 분석 또는 질량 분석법과 같은 기존 방법에 비해 더 나은 시간 분해능을 달성합니다. 이 방법은 연구자들이 서로 다른 소기관과 막 사이의 지질 추출 및 교환을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

FRET(Förster 공명 에너지 전달)는 생체 분자 시스템을 연구하는 강력한 방법입니다. 이 기술은 단일 분자(예: smFRET)에 적용할 수 있으며 생체 분자 내의 절대 거리를 측정할 수 있습니다. Abdelhamid et al.4 은 자유롭게 확산되는 단일 분자에서 두 염료 사이의 FRET 효율을 측정할 수 있는 최근 개발된 공초점 설정인 smfBox를 수행하는 방법에 대한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 시료 전처리부터 기기 설정, 정렬, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 smFRET 기술을 구현하고 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한 정확한 FRET 파생 거리 측정에 필요한 보정 계수를 결정하는 방법을 설명합니다. 여기서, 이 방법은 자유롭게 확산되는 DNA 이중체에 적용되며 단백질 형태 변화 또는 단백질-DNA 상호 작용 연구와 같은 광범위한 응용 분야로 확장될 수 있습니다.

생물학적 과정에는 새로운 형광 기반 분석 또는 센서의 개발을 위한 충분한 공간을 남겨두는 매우 다양하고 수많은 생체 분자 상호 작용이 포함됩니다. 이 컬렉션은 연구자들에게 형광 기반 방법의 혁신과 발전에 대한 개요를 제공합니다. 각 기사는 다양한 형광 기반 방법을 조명하여 형광 분석이 얼마나 중요하고 다양해졌는지 강조합니다. 이 컬렉션은 이러한 방법을 설명하므로 다양한 그룹과 연구 분야에서 광범위한 사용을 장려합니다.

공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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M-L. J.는 Fondation pour la Recherche Médicale (FRM ARF201809006996)의 자금 지원을 받았습니다.

참고문헌

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  1. Reiser, A., Woschée, D., Kempe, S. M., Rädler, J. O. Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a versatile technique to quantify cellular kinetics. Journal of Visualized Experiments. (169), e62025(2021).
  2. Konate, K., Seisel, Q., Vivès, E., Boisguérin, P., Deshayes, S. Fluorescent leakage assay to investigate membrane destabilization by cell-penetrating peptide. Journal of Visualized Experiments. (166), e62028(2020).
  3. Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, M., Drin, G. Fluorescence-Based measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate exchange between membranes. Journal of Visualized Experiments. (169), e62177(2021).
  4. Abdelhamid, M. A. S., Rhind-Tutt, A. V., Ambrose, B., Craggs, T. D. Making precise and accurate single-molecule FRET measurements using the OpenSource smfBox. Journal of Visualized Experiments. (173), e62378(2021).

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