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역사적으로 과학자들은 의료 제품(예: 의약품 또는 의료 기기)을 인간에게 테스트하기 전에 안전한지 확인하기 위해 동물 연구에 크게 의존해 왔습니다. 동물 실험은 여전히 많은 상황에서 정당화되지만 대안을 찾는 것이 매우 바람직합니다. 최근 과학과 공학의 발전으로 동물 실험에 대한 대안 개발이 그 어느 때보다 실현 가능해졌습니다. 심장 안전성 평가를 위한 인간 체외 대체 방법 개발에 대한 새로운 초점은 적어도 부분적으로 유도만능줄기세포(iPSC) 기술의 발전에 기인합니다. 인간 심장 세포는 환자의 간단한 혈액 또는 피부 샘플을 사용하여 실험실에서 생성될 수 있으며, 이는 강력한 고처리량 테스트에 적합한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(iPSC-CM)를 생산할 수 있습니다. 3D 조직 생명 공학, 미세 전극 어레이 기술, 살아있는 세포 이미징 및 기타 기술의 발전도 이 컬렉션에 포함된 프로토콜의 개발에 중요한 역할을 했습니다.
Gerges et al.1 의 프로토콜은 비침습적 광학 방법(MyoBLAZER)을 적용하여 성인 인간 원발성 심실 심근 세포의 수축성 변화를 평가합니다. 세포는 전기적으로 페이싱되며 이미지 분석은 여러 세포에 걸쳐 병렬로 근절 단축을 측정합니다. 이 방법은 장치당 화합물당 30분마다 농도-반응 곡선을 수집할 수 있으며 구조-활성 관계 데이터를 제공합니다. 이 비침습적 광학 방법은 고처리량 스크리닝 중에 성인 인간 심근 세포의 생리학 및 약리학을 보존하는 데 도움이 됩니다. 또한 인간 성인 심근 세포를 사용하면 수축성을 예측하는 데 중요한 번역 부분을 제공할 수 있습니다.
Lickiss et al.2 의 방법론은 하이브리드 수축성 및 임피던스/세포외 전위(EFP) 기술을 제시하여 부드럽고 유연한 실리콘 기반 세포 배양 기질을 사용하여 산업 표준 96웰 플랫폼에 중요한 성숙 촉진 기능을 추가합니다. 이 접근법은 3D 시스템이 필요 없이 표준(뻣뻣한 기질) 배양에 고의로 존재하지 않는 상업적으로 이용 가능한 건강한 hiPSC-CM에서 이소프로테레놀에 대한 생리학적 양성 수축 반응을 재확립함으로써 성공적인 것으로 입증되었습니다. 하이브리드 시스템을 사용하면 수축력(mN/mm2), 박동률, 셀 단층 밀도 및 무결성을 직접 측정할 수 있습니다. 또한 기존 3D 시스템의 문제(예: 낮은 처리량, 상당한 교육 요구 사항)를 해결하여 분석을 완료하는 데 필요한 시간과 비용을 줄입니다.
이 컬렉션에는 프로브가 없는 비디오 기반 현미경을 사용하여 유연한 Matrigel 매트리스에 도금된 2D 인간 줄기 세포 심근 세포에서 심장 수축성 조절(CCM) 요법을 평가하기 위한 시험관 내 고처리량, 비침습적 방법을 시연하는 Feaster et al.3의 작업도 포함되어 있습니다. 저자는 건강하고 병든 hiPSC-CM의 수축 특성에 대한 CCM의 급성 효과를 강조합니다. 이 도구는 CCM의 안전성 또는 효능을 이해할 수 있는 저렴한 방법을 제공하며 동물 연구에 대한 의존도를 줄이고 심장 전기생리학 의료 기기의 규제 의사 결정을 지원할 수 있습니다.
Schaefer et al.4 에 의해 개선된 프로토콜은 일반적으로 hiPSC-CM에서 세포외 전위를 기록하는 표준 미세전극 어레이(MEA) 시스템에 대한 새로운 확장을 설명하여 나노초 레이저 빔 펄스로 세포막을 열어 세포 내 유사 활동 전위 기록을 허용합니다. 이 장치는 표준 MEA 장점(즉, 신호 전파 모니터링, 급성 및 만성 실험)을 포함할 뿐만 아니라 세포 전기천공을 위한 강한 전기장 펄스를 사용하지 않고도 세포 내 유사 활동 전위 모양에 대한 통찰력을 제공합니다.
Berry et al.5 의 프로토콜은 직접적인 수축력 측정을 위해 3D 엔지니어링 근육 조직(EMT)의 재현 가능한 제작을 가능하게 하는 새로운 플랫폼을 설명합니다. 이 기기는 수축력의 마이크로뉴턴 변화를 감지 할 수 있으므로 용량 의존 화합물 스크리닝을위한 강력한 도구입니다. 골격근 조직뿐만 아니라 hiPSC 기반 심장 조직의 수축성은 최대 24개의 조직에서 동시에 기록될 수 있으며 데이터는 몇 주 또는 몇 달에 걸쳐 종단적으로 분석될 수 있습니다. 따라서 연구자에게는 최소한의 추가 기술이나 교육이 필요합니다.
마지막으로, Zhao et al.6 의 간행물은 사용자 실험실에서 사내에서 생성할 수 있는 심근 세포와 함께 사용하도록 최적화된 일련의 기능 분석(세포외 필드 전위, 활동 전위, 수축성 및 칼슘)을 설명합니다. 이는 이전에 발표된 Stanford University Cardiovascular Institute Biobank(https://med.stanford.edu/scvibiobank/request-cells.html)에서 사용할 수 있는 iPSC를 사용하여 수행할 수 있으며, 광범위한 "병타" 및 대조 세포를 제공합니다. 이것은 표준 접근법(패치 클램프, 미세 전극 어레이, 칼슘 민감성 형광 프로브 및 비디오 기반 수축성 측정)을 포함하여 주요 심장 수축성 및 전기생리학 기록을 위한 완전한 방법 세트입니다.
결론적으로, 현재 방법 모음이 완전하다고 주장하지는 않지만(계속 성장하고 있음) 이미 인간 심근 세포의 수축성 및 전기생리학적 기록에 대한 많은 현재 문제를 보여주는 비교적 포괄적인 방법 세트입니다. 여기에는 일차 인간 심근 세포에 대한 프로토콜1, 건강한 기증자로부터 유래한 상업적으로 이용 가능한 hiPSC-CM 2,3,4 및 선천성 심장 질환의 시그니처를 운반하는 세포에 최적화된 프로토콜이 포함됩니다 3,6. 이러한 방법은 패치 클램프 실험을 위한 단일 세포6부터 뻣뻣한 기질 1,4의 기존의 hiPSC-CM 2D 단층, 부드럽고 유연한 기질 2,3의 2D 심근 세포 단층, 마지막으로 3D 조작 심장 조직5에 이르기까지 다양한 세포 배양 조건에 걸쳐 있습니다. 포함된 방법은 수축성(비디오 기반 분석으로 간접적으로 측정됨 1,3,6 또는 수축력 2,5로 직접 측정됨), 활동 전위(패치 클램프6, MEA 4,6을 사용한 대리 세포외 필드 전위)와 같은 가장 관련성이 높은 심장 생리학 매개변수의 기록을 위해 다양한 접근 방식을 사용합니다., 또는 표준 MEA 시스템4) 및 칼슘 과도 현상(칼슘 민감성 프로브6 사용)으로 활동 전위 유사 기록을 기록하기 위해 세포를 포팅하는 새로운 접근 방식을 사용합니다. 종합하면, 이러한 방법은 다른 실험실에서 재현할 수 있는 상세한 프로토콜을 제공할 뿐만 아니라 다음과 같은 인간 심장 시험관 내 방법의 몇 가지 문제를 보여줍니다. hiPSC-CM 미성숙, 특히 뻣뻣한 기질에 표준 2D 배양을 사용할 때; 형광 전압 또는 칼슘 민감성 프로브의 원치 않는 효과; 기존 활동 전위 기록의 낮은 처리량; 표준 필드 잠재적 지속 시간 기록의 해석의 어려움; 의료 기기 평가를 위한 분석이 부족합니다(예: 약물 대비). 얼마나 많은 실험실이 이러한 방법을 개선하기 위해 노력하고 있으며, 이는 필연적으로 미래에 이러한 방법의 광범위한 적용으로 이어질 것입니다.