방법 논문

LC3 면역형광법을 사용하여 두 가지 다른 췌장 세포 모델에서 자가포식 수준 평가

DOI:

10.3791/65005

⸱

2023년 4월 28일

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Bioquimica y Medicina Molecular Prof Alberto Boveris (IBIMOL), Universidad de Buenos Aires, CONICET, 2Signalling Programme, The Babraham Institute

이 논문에서

요약

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이 프로토콜의 목표는 LC3 면역형광 및 LC3 도트 정량화를 통해 췌장암 및 췌장 전초 세포의 자가포식 수준을 결정하는 것입니다.

초록

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자가포식은 단백질과 손상된 세포 소기관을 포함한 세포질 성분을 선택적으로 분해하는 특수한 이화 과정입니다. 자가포식은 세포가 스트레스 자극에 생리적으로 반응하여 세포 항상성을 유지하도록 합니다. 암세포는 저산소증, 영양 결핍 또는 화학 요법으로 인한 손상과 같은 불리한 조건에 적응하기 위해 자가포식 수준을 조절할 수 있습니다. 관 췌장 선암종은 가장 치명적인 유형의 암 중 하나입니다. 췌장암 세포는 자가포식 단백질의 전사 상향 조절 및 번역 후 활성화로 인해 높은 자가포식 활성을 가지고 있습니다.

여기서, 췌장 인간 암세포의 모델로 PANC-1 세포주를 사용하였고, 고도로 분화된 포유류 세포의 생리학적 모델로 AR42J 췌장 선엽 세포주를 사용하였다. 이 연구는 자가포식 활성화 상태의 지표로 미세소관 관련 단백질 경쇄 3(LC3)의 면역형광을 사용했습니다. LC3는 기저 조건에서 세포질의 확산 분포 패턴을 나타내는 자가포식 단백질입니다(이 조건에서는 LC3-I로 알려짐). 자가포식 유도는 새로 형성된 자가포식소체 표면의 포스파티딜에탄올아민에 대한 LC3의 접합을 촉발하여 자가포식소체의 형성 및 확장을 돕는 막 결합 단백질인 LC3-II를 형성합니다. 라벨이 붙은 자가포식 구조의 수를 정량화하기 위해 오픈 소스 소프트웨어 FIJI가 "3D Objects Counter" 도구를 사용하여 활용되었습니다.

생리적 조건과 암세포 모두에서 자가포식 수준을 측정하면 저산소증, 화학 요법 치료 또는 특정 단백질의 녹다운과 같은 다양한 조건에서 자가포식의 조절을 연구할 수 있습니다.

서론

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Macroautophagy (일반적으로 autophagy라고 함)는 단백질과 손상된 세포 소기관을 포함한 세포질 구성 요소를 선택적으로 분해하는 특수 이화 과정입니다 1,2. 자가포식은 세포가 스트레스 자극에 생리학적으로 반응하여 세포 항상성을 유지하도록 합니다3. autophagy 동안, 이중 막 소포가 형성됩니다 : autophagosome. 자가포식소체는 화물 분자를 포함하고 분해를 위해 리소좀으로 유도합니다 1,4.

자가포식소체는 자가포식 단백질 미세소관 관련 단백질 경쇄 3(LC3)5에 의해 장식됩니다. 자가포식이 유도되지 않을 때, LC3는 LC3-I 입체형태의 세포질 및 핵에서 확산된다. 한편, 자가포식이 유도되면, LC3은 자가포식 구조6의 막에서 포스파티딜에탄올아민과 접합된다. 이 새로운 LC3 형태는 LC3-II1로 알려져 있습니다. LC3 형태 이....

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프로토콜

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1. 세포 준비

  1. 12mm 원형 커버슬립을 무수 에탄올에 담그고 24웰 플레이트의 웰에 수직으로 놓습니다.
  2. 덮개를 제거하고 멀티웰 플레이트를 15분 동안 자외선에 노출시킵니다.
  3. 커버슬립을 수평으로 놓고 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)으로 세척합니다.
  4. 낮은 통로 수의 췌장 세포를 시드하십시오. 고정 당일 50%-75% 밀도를 얻기 위해 양을 조정해야 합니다16.
    참고: 3일 후에 세포를 고정하기 위해 웰당 2.5 × 10 4PANC-1 또는 4 ×10 4 AR42J 세포를 시딩하는 것이 좋습니다.
  5. 5% 이산화탄소(CO2)로 가습된 분위기 하에서 37°C의 인큐베이터에서 10% 소 태아 혈청, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에서 세포를 배양합니다.
    참고: PANC-1 세포의 경우 세포 파종과 다음 단계 사이에 2일 동안 세포를 배양하는 것이 좋습니다. 이 시간 후에, 세포는 형질감염, 치료, 또는 고정될 수 있다. 이 프로토콜은 형질주입되지 않은 PANC-1 세포에서의 젬시타빈에 의한 처....

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결과

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이 프로토콜은 췌장 세포주에서 LC3의 면역형광을 수행하여 다양한 조건에서 자가포식 수준을 결정합니다. 이 실험의 결과는 LC3 및 DAPI에 해당하는 적색 및 청색 채널에서 세포 이미지를 획득하는 것이었습니다. LC3 이미지는 이 단백질의 세포 분포를 나타내는 반면 DAPI는 핵 국소화를 나타냅니다. 도 2A 는 기저 또는 젬시타빈 처리 조건 하에서 PANC-1 세포에서 LC3의 면역형광 및 DAPI 염색과의 병합의 대표적인 이미지를 나타낸다. LC3 염색의 이미지 세트는 FIJI의 도구 3D Objects Counter 를 사용하여 분석되었습니다. 이 소프트웨어를 사용하여 세포당 LC3 도트의 양을 정량화했습니다. 도 2B 의 막대 그래프는 기저 대 젬시타빈 처리 조건 하에서 PANC-1 세포에서의 LC3 도트 정량화의 결과를 보여준다. 이 그래프에서 LC3 도트는 젬시타빈 처리 하에서 유.......

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토론

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이 프로토콜에 설명된 방법을 사용하면 세포 내 내인성 LC3 분포를 시각화하고 다양한 조건에서 자가포식 수준을 정량화할 수 있습니다. LC3 분포를 분석하고 자가포식 활성화를 결정하는 데 사용되는 또 다른 유사한 방법은 형광 표지된 LC3 형질감염(예: RFP-LC3)을 포함합니다19. RFP-LC3 형질감염은 고정을 필요로 하지 않고(이는 생세포 이미징(20)에서 이 방법을 적용할 수 있게 함), 더 저렴하고, LC3 항체 반응성에 의존하지 않는다는 장점을 갖는다. 한편, LC3의 면역형광은 내인성 LC3의 이미지를 제공하는 이점이 있으며, 따라서 자가포식과 무관한 단백질 응집체의 형성과 같은 LC3 과발현과 관련된 가능한 문제를 피할 수 있습니다(21). 또한, 이 방법은 세포 형질감염의 용이성에 의존하지 않으며, 이는 다양한 세포주에 적용할 수 있음을 의미합니다. 그러나 사용되는 LC3 항체와 그.......

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공개 사항

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이해 상충은 선언되지 않았습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 부에노스 아이레스 대학교 (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), 국립 과학 연구 기술위원회 (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO 및 PUE 22920170100033) 및 국립 과학 기술 진흥기구 (PICT 2019-01664).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10x 인산염 완충 식염수(PBS)Corning46-013-CM
12mm 원형 커버슬립HDACBR_OBJ_6467
24 웰 세포 배양 플레이트Sorfa220300
앱솔루트 에탄올Biopack2207.10.00
Alexa Fluor 594 당나귀 안티 토끼 IgG (H+L)InvitrogenR37119
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경ZeissLSM 800
DexamethasoneSigma AldrichD4902
DMENSartorius01-052-1A
태아 소 세럼NATOCOR Lintc-634
GemcitabinaEli LillyVL7502
LC3B (D11) XP Rabbit mAb세포 신호 전달 기술3868S
메탄올Anedra6197
파라필름 "M" (실험실 밀봉 필름)Bemis/CurwoodPM-996
펜 연쇄상 구균 용액장갑03-031-1B
PP242산타 크루즈 생명 공학SC-301606
트립신 EDTAGibco11570626

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146(2018).
  2. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36<....

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PANC 1 CellsAR42J CellsGemcitabine TreatmentConfocal Microscopy3D Objects CounterMethanol FixationDAPI Staining

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