방법 논문

근골격계 연구: 현재의 방법과 혁신적인 접근법

DOI:

10.3791/65009

⸱

2023년 3월 3일

1Center for Orthopaedic Research and Translational Science (CORTS), The Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, The Pennsylvania State University College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University College of Medicine, 4Center for RNA Molecular Biology, Pennsylvania State University

이 논문에서

초록

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논의 된 기사 :

Lee J. I., Govindappa, P. K., Wandling, G. D., Elfar, J. C. 생쥐의 외상성 말초 신경 손상. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (181), e63551 (2022).

Dunning, L., McCulloch, K., Lockhart, J. C., Goodyear, CS, Huesa, C. 가속 골관절염의 내측 반월상 연골 및 연골 스크래치 쥐 모델의 불안정화. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (185), e64159 (2022).

Jagadeeshaprasad, M. G., Govindappa, P. K., Nelson, A. M., Elfar, J. C. 인간 포피에서 1차 슈반 세포, 각질 세포 및 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (181), e63776 (2022).

Hain, B. A., Waning, D. L. 마우스 골격근에 플라스미드 DNA의 전기천공법. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (182), e63916 (2022).

Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용한 골절 치유 평가. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (190). E64262 (2022).

사설

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근골격계 질환은 수백만 명의 사람들을 괴롭히고 있으며 전 세계적으로 장애의 주요 원인입니다1. 그럼에도 불구하고 근골격계 질환은 다른 널리 퍼진 만성 질환(예: 암 및 당뇨병)에 비해 연구가 부족하고 잘 이해되지 않습니다. 또한, 근골격계 질환과 관련된 장애의 유병률이 증가할 것으로 예상되며, 이는 근골격계 질환의 발병과 진행을 뒷받침하는 분자 메커니즘과 세포 경로를 조사하는 연구의 중요성을 강조합니다. 이에 따라 분자 수준에서 근골격계 질환을 더 잘 이해하고 혁신적인 치료법 개발을 촉진할 수 있는 방법론에 대한 필요성이 증가하고 있습니다.

말초 신경 손상은 외상 사례의 ~3%와 관련이 있으며 정형외과 외상 환자의 이환율의 일반적인 원인입니다2. 그러나 외상성 말초신경손상(TPNI)과 관련된 신경 기능을 구출하고 근육 위축을 역전시키는 정확한 치료법은 여전히 파악하기 어렵습니다3. 따라서 쥐 모델에 대한 연구는 연구용 TPNI 치료의 효능을 평가하는 데 중요한 역할을 합니다. 그러나 이 분야에는 신뢰할 수 있는 기능 회복 측정 또는 신경 재생의 특성화를 가능하게 하는 예측 가능한 신경 절개 동물 모델이 부족합니다. 이 방법 모음에 포함된 연구에서 Lee et al. 고정된 부상 패턴을 보장하고 기능 회복 측정을 용이하게 하는 TPNI 모델을 설명합니다4. 일반적으로 TPNI 후 기능 회복은 부상의 중증도에 따라 다르며, Lee et al.4 에서 설명한 프로토콜의 주요 장점은 신경 분쇄 수술 중 압력 변화를 실시간으로 모니터링하는 보정된 디지털 장치를 사용한다는 것입니다. 이는 유도된 부상의 중증도와 그에 따른 회복의 가변성을 제한합니다.

골관절염(OA)은 노인의 하지에 영향을 미치는 장애의 주요 원인이므로 주요 사회적, 경제적 부담을 구성합니다5. 외상 후 OA의 내측 반월상연골(DMM) 모델의 널리 사용되는 불안정화를 포함하여 OA 발달 단계를 모방하는 쥐 모델이 존재합니다 6,7. Dunning et al. DMM 모델의 수정된 버전인 OA의 불안정화 및 연골 스크래치(DCS) 모델을 소개하며, 연골 표면에 3개의 스크래치를 도입하여 연골에 추가 손상을 부여하는 것을 포함합니다8. DCS 모델은 OA의 가속 모델을 나타내며 OA 초기 단계에서 골극 형성, 활막 염증, 뼈 리모델링 및 통증 측정에 초점을 맞춘 연구에 적합합니다. 이 모델은 또한 관절경 수술 및 기타 임상 개입 중에 연골에 직접 가해지는 손상을 요약합니다.

생쥐에서는 실현 불가능한 몇 가지 기계론적 연구를 배양 세포에서 수행할 수 있으며, 이는 생체 내 연구를 보완하는 시험관 내 실험의 중요성을 강조합니다. 일차 세포는 안정적인 세포주보다 내인성 생체 내 조건을 더 충실하게 요약하기 때문에 중요한 연구 도구입니다. 따라서 다양한 근골격계 조직에서 생존 가능한 일차 세포의 분리를 용이하게 하는 프로토콜을 개발하는 것은 이 분야의 연구를 발전시키는 데 필수적입니다. Jagadeeshaprasad et al. 각질 세포, 섬유아세포 및 슈완 세포(SC)의 세 가지 유형의 일차 세포를 동시에 분리하기 위해 인간 신생아 포피의 효소 및 기계적 소화에 대한 방법론을 자세히 설명합니다9. 피부에서 SC를 분리하는 것은 이 프로토콜이 각질세포와 섬유아세포를 분리하기 위한 잘 확립된 프로토콜에 도입하는 주요 발전을 나타냅니다. 이 프로토콜은 세 가지 세포 유형의 공동 배양을 용이하게 하며, 이는 각질 세포 및 섬유아세포의 항상성 및 기능을 조절하는 SC의 잠재적 역할을 조사하는 연구에 필수적입니다.

과발현과 녹다운은 유전자 기능을 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 접근 방식입니다. 이러한 실험은 시험관 내 세포 배양에서 쉽고 일상적으로 수행되지만 플라스미드 DNA 또는 작은 간섭 RNA를 표적 세포/조직에 효율적으로 전달하는 데 어려움이 있기 때문에 생체 내에서 유전자 발현을 조작하는 것이 더 어렵습니다. Hain과 Waning은 DNA 플라스미드를 마우스 골격근에 전기천공하여 근섬유10에서 암호화된 단백질을 과발현하는 쉬운 프로토콜을 설명합니다. 골격근에 DNA 플라스미드를 주입하거나 전기천공하기 위한 기존 프로토콜의 주요 단점은 이러한 절차가 근육 수축성에 부정적인 영향을 미친다는 것입니다. Hain과 Waning10 에 의해 도입된 프로토콜은 골격근 수축성을 손상시키지 않기 때문에 이러한 한계를 해결하여 다양한 단백질 발현의 기능적 결과로서 근육 수축성을 평가할 수 있습니다.

마이크로 컴퓨터 단층촬영(μCT)은 뼈의 3차원(3D) 구조를 평가하는 데 일반적으로 사용되는 영상 기법입니다11. μCT는 임상에서 인간 뼈 영상을 위한 황금 표준이며 전임상 연구에서 뼈 구조 및 뼈 재생을 평가하는 데 매우 널리 사용됩니다12. μCT는 광물화된 뼈에서 얻은 많은 수의 X선 이미지를 포함하며, 이는 본질적으로 X선과 대비가 우수합니다. 골절 치유 과정에서 뼈 형성을 평가하는 데 사용될 때 μCT는 치유 굳은살의 3D 구조와 밀도에 대한 자세한 정보를 제공합니다. μCT를 사용한 온전한 뼈의 정량화는 잘 확립되어 있지만 골절 굳은살 평가를 위한 μCT 프로토콜에 대한 합의가 부족합니다. Wee et al. 골절 치유의 여러 단계에서 골절 굳은살을 정확하게 평가하기 위한 표준화된 단계별 프로토콜을 제공합니다13. 이 프로토콜은 이미지 시각화, 재정렬 및 굳은살 분할을 가능하게 하는 최첨단 분석 플랫폼을 사용합니다. 이러한 기여는 현장 전반에 걸쳐 골절 굳은살 분석을 위한 보다 표준화되고 일관된 접근 방식을 확립하는 데 도움이 될 것입니다.

요약하면, 이 방법 컬렉션은 뼈, 연골, 말초 신경, 골격근 및 피부와 같은 광범위한 근골격계 조직에 사용되는 실험 프로토콜을 제시합니다. 우리는 이 컬렉션이 빠르게 성장하는 근골격계 연구 분야의 전문가뿐만 아니라 신규 이민자에게도 유용하기를 바랍니다. 이 분야의 미래는 새로운 연구 방법론 개발을 목표로 하는 지속적인 노력으로 크게 향상될 것입니다. 근골격계 질환에 대한 새로운 쥐 모델을 확립하고 근골격계 조직에 치료제를 국소적으로 표적으로 전달하기 위한 혁신적인 접근법을 개발하려는 노력은 특히 가치가 있습니다.

공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 미국 국립보건원(NIH)의 지원을 받아 R01 DK121327를 받았습니다.

참고문헌

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  1. Liu, S., et al. Global burden of musculoskeletal disorders and attributable factors in 204 countries and territories: A secondary analysis of the Global Burden of Disease 2019 study. BMJ Open. 12 (6), 062183(2022).
  2. Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23 (6), 863-873 (2000).
  3. Faroni, A., Mobasseri, S. A., Kingham, P. J., Reid, A. J. Peripheral nerve regeneration: Experimental strategies and future perspectives. Advanced Drug Delivery Reviews. 82-83, 160-167 (2015).
  4. Lee, J. I., Govindappa, P. K., Wandling, G. D., Elfar, J. C. Traumatic peripheral nerve injury in mice. Journal of Visualized Experiments. (181), e63551(2022).
  5. Katz, J. N., Arant, K. R., Loeser, R. F. Diagnosis and treatment of hip and knee osteoarthritis: A review. Journal of the American Medical Association. 325 (6), 568-578 (2021).
  6. Pinamont, W. J., et al. Standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model. Journal of Visualized Experiments. (159), e60991(2020).
  7. Carlson, E. L., et al. Paroxetine-mediated GRK2 inhibition is a disease-modifying treatment for osteoarthritis. Sci Transl Med. 13 (580), 8491(2021).
  8. Dunning, L., McCulloch, K., Lockhart, J. C., Goodyear, C. S., Huesa, C. Destabilization of the medial meniscus and cartilage scratch murine model of accelerated osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (185), e64159(2022).
  9. Jagadeeshaprasad, M. G., Govindappa, P. K., Nelson, A. M., Elfar, J. C. Isolation, culture, and characterization of primary Schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin. Journal of Visualized Experiments. (181), e63776(2022).
  10. Hain, B. A., Waning, D. L. Electroporation of plasmid DNA into mouse skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (182), e63916(2022).
  11. Muller, R., et al. Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed. Bone. 23 (1), 59-66 (1998).
  12. Christiansen, B. A. Effect of micro-computed tomography voxel size and segmentation method on trabecular bone microstructure measures in mice. Bone Reports. 5, 136-140 (2016).
  13. Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. Assessment of bone fracture healing using micro-computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (190), e64262(2022).

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Peripheral Nerve InjuryOsteoarthritisMedial MeniscusCartilage ModelSchwann CellsKeratinocytesFibroblastsElectroporationPlasmid DNABone Fracture HealingMicro computed Tomography

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