Method Article

Stub1 매개 Pexophagy 모니터링

DOI:

10.3791/65010

⸱

May 12th, 2023

 , 
1Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica, 2Institute of Biochemical Sciences, College of Life Sciences, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 살아있는 세포에서 Stub1 매개 pexophagy를 트리거하고 모니터링하기 위한 지침을 제공합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포유류 세포는 Stub1 매개 pexophagy를 통해 과산화소체를 뒤집을 수 있습니다. 이 경로는 잠재적으로 과산화소체의 양과 질에 대한 세포 제어를 허용합니다. 이 과정에서 열 충격 단백질 70과 유비퀴틴 E3 리가아제인 Stub1은 과산화소체로 전위되어 펙소파지를 시작합니다. Stub1 리가제 활성은 표적 과산화소체에 유비퀴틴 및 기타 자가포식 관련 모듈의 축적을 허용합니다. 퍼옥시좀 루멘 내에서 활성 산소종(ROS) 수준을 높이면 Stub1 매개 축척을 활성화할 수 있습니다. 따라서 염료 보조 ROS 생성을 사용하여 이 경로를 트리거하고 모니터링할 수 있습니다. 이 기사에서는 포유류 세포 배양 내에서 펙소파지를 시작하기 위해 형광 단백질과 합성 형광단의 두 가지 종류의 염료를 사용하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이러한 염료 보조 ROS 생성 기반 프로토콜은 전 세계적으로 세포 집단 내의 모든 과산화소체를 표적으로 삼는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 단일 세포 내에서 개별 과산화소체의 조작을 허용할 수도 있습니다. 또한 생세포 현미경을 사용하여 Stub1 매개 pexophagy를 추적하는 방법도 설명합니다.

Introduction

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과산화소체는 대부분의 진핵 세포에 존재하는 단일 막 결합 소기관입니다. 과산화소체는 매우 긴 사슬 지방산의 베타 산화, 퓨린 이화 작용, 에테르 인지질 및 담즙산 합성을 수행하는 데 필수적인 대사 구획입니다1. 과산화소체 유래 아세틸-CoA는 대사에서 중추 신호 전달을 조절하여 지질 항상성을 조절합니다2. 따라서 손상된 과산화소체 기능이 신경퇴행성 장애, 노화, 암, 비만 및 당뇨병을 포함한 다양한 질병에 내포되어 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다 3,4,5. 퍼옥시솜 작동의 유지에 필수적인 과정은 pexophagy입니다. Pexophagy는 autophagy에 의한 peroxisomes의 선택적 회전율을위한 이화 작용 과정입니다. 세포는 펙소파지를 사용하여 과산화소체의 양과 질을 조절하여 적절한 과산화소체 기능을 보장합니다. 최근 연구에 따르면 PEX1 퍼옥시좀 생물 발생 인자 1 및 6의 돌연변이로 인한 과산화소체 손실은 제어되지 않은 pexophagy6의 ....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 퍼옥시좀 루멘에서 diKillerRed 또는 자가 표지 단백질(SLP)을 발현하는 세포의 제조

  1. 유리 바닥의 세포 배양 접시에 원하는 세포를 뿌립니다. 여기에서 실험을 위해 840μL의 배양 배지 (10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F-12)의 2 x 10 5 인간 SHSY5Y 세포 또는 직경 20mm 유리 마이크로웰이 있는 35mm 배양 접시에 840μL의 배양 배지(10% 소 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM)의 6 x 104 마우스 NIH3T3 세포.
    주: 씨를 뿌린 세포의 수는 다른 명세의 유리제 밑바닥 접시를 사용할 경우의 유리제 마이크로웰 지역에 따라 비례적으로 조정되어야 합니다.
  2. 세포를 5%CO2/37°C 하에서 24시간 동안 성장시킨다.
  3. 형질주입 시약을 사용하여 원하는 플라스미드로 세포를 형질주입합니다.
    1. PMP34-TagBFP를 사용하여 살아있는 세포의 과산화소체를 라벨링합니다. 과산화소체 내강에서 ROS 생성을 위해 과산화소체 표적 diKillerRed-VKSKL 또는 SLP-VKSKL(+ 염료 표지 SLP 리간드)을 사용합니다(광 활성화 ROS 생산을 통....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 표시된 Stub1 매개 pexophagy 유도 방식은 퍼옥시좀 내강 내에서 염료 보조 ROS 생성을 활용합니다. 이 작업에는 최소한의 광도가 필요합니다. 따라서 형광 단백질 또는 염료를 포함하는 과산화소체는 표준 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 조명할 수 있습니다. 초점 조명은 형광 리포터 roGFP2-VKSKL에 의해 표시된 바와 같이 개별 과산화소체 내에서 즉각적이고 국부적인 ROS 생성으로 이어집니다(그림 9). 이미징 중 추가 ROS 생성을 방지하기 위해 roGFP2-VKSKL 측정에서 diKillerRed-VKSKL을 이미지화하지 않았습니다. 그림 9 의 오른쪽 하단 diKillerRed-VKSKL 이미지는 손상된 과산화소체가13인 위치를 명확하게 나타내기 위해 모든 roGFP2-VKSKL 측정을 수행한 후에 촬영되었습니다. 데이터는 또한 조명되지 않은 과산.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 빛으로 퍼옥시좀 ROS 수준을 높여 세포 배양 내에서 Stub1 매개 pexophagy를 유발하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 염료 보조 ROS 생성에 의존하기 때문에 관심 세포 내에서 diKillerRed-VKSKL 또는 염료 표지 SLP 리간드 염색의 충분한 발현을 보장해야 합니다. 서로 다른 세포 유형 또는 서로 다른 유전적 배경을 가진 세포가 약간 다른 특성을 가진 과산화소체를 보유할 수 있다는 점을 감안할 때, 축척의 유도를 보장하기 위해 정확한 조명 조건을 조정해야 할 수도 있습니다. Stub1 매개 pexophagy의 활성화를 스크리닝하기 위한 강력한 조치는 EGFP-Ub가 조명된 과산화소체(조명 후 1시간)로 전위되는지 여부를 모니터링하는 것입니다13. 건강한 세포에서 EGFP-Ub 신호는 일반적으로 세포질에 고르게 분포됩니다. 따라서 조명된 과산화소체로의 전위는 관찰하기 쉽습니다. 조명 조건을 최적화하기 위해 광도 또는 조명 시간을 변경할 수 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁하는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 대만 국립 과학 기술위원회 (National Science and Technology Council)의 MOST 111-2311-B-001-019-MY3 연구 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
20mm 직경의 유리 마이크로웰이 있는 35mm 배양 접시 MatTekP35G-1.5-20-C20mm 유리 바닥
3-아미노-1,2,4-트리아졸(3-AT)Sigma AldrichA8056
소 혈청ThermoFisher Scientific16170060
세포 배양 인큐베이터NuaireNU-4750
diKillerRed-PTS1Academia SinicaKillerRed 탠덤 이량체에 PTS1(VKSKL)을 추가하여 만든
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher Scientific11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)ThermoFisher Scientific11330032
EGFP-C1ClontechpEGFP-C1EGFP-C1의 골격은 EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70Academia Sinica클로닝에 사용되었습니다.Hsp70 유전자 (HSPA1A) HeLa cDNA에서 증폭되고 EGFP-C1
EGFP-LC3BAddgene11546
EGFP-p62Academia Sinica인간 SQSTM1 유전자를 EGFP-C1
EGFP-Stub1Academia Sinica삽입하여 생성 (전체 마우스 신장 cDNA의 PCR 증폭을 통해) EGFP-C1
EGFP-UbAddgene11928
태아 소 혈청ThermoFisher Scientific10437028
HaloTag TMR 리간드 PromegaG8252
HaloTag-PTS1Academia SinicaPTS1은 EGFP-C1 백본에 추가 및 복제
HEPESThermoFisher Scientific15630080
Inverted Confocal Microscope OlympusFV3000RS405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  TOKAI HIT 챔버 인큐베이터와 UNIV2-D35 접시 부착물이 있는 현미경
Janelia Fluor 646 HaloTag LigandPromegaGA1120
LEDVitaStarPAR6480 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000 ThermoFisher Scientific11668형질주입 시약
NIH3T3 세포ATCCCRL-1658부착
Opti-MEMThermoFisher Scientific319850환원된 혈청 배지
페니실린/스트렙토마이신ThermoFisher Scientific15140
PMP34-TagBFPAcademia SinicaPMP34 PCR HeLa cDNA에서 증폭 및 클로닝 intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1Academia SinicaeroGFP(Addgene plasmid 20131에서 가져옴)에 아미노산 서열 VKSKL을 추가하여 생성되고 EGFP-C1
SHSY5Y 세포ATCCCRL-2266준수
, 로 복제됨 에 되었습니다. 는 에 복제됩니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83(2016).
  2. He, A., et al.

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Stub1 Mediated PexophagyPeroxisome TurnoverReactive Oxygen SpeciesDye Assisted ROS GenerationUbiquitin E3 LigaseLive Cell MicroscopyFluorescent ProteinsSynthetic FluorophoresAutophagy AdaptersConfocal Microscopy

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