In Vitro 및 In Vivo 모델을 사용한 세포외 Vesicle-Mediated Vascular Calcification 분석

요약

이 논문은 광물화 가능성을 관찰하기 위해 쥐 대동맥을 분리한 후 석회화된 세포외 소포를 추출하여 혈관 석회화를 얻고 평가하는 방법론을 제시합니다.

초록

심혈관 질환은 세계의 주요 사망 원인이며 혈관 석회화는 심혈관 사건의 가장 중요한 예측 인자입니다. 그러나 현재 혈관 석회화에 대한 치료 또는 치료 옵션은 없습니다. 석회화는 칼슘과 인산 이온을 응집시켜 핵 초점 역할을 하는 특수 세포외 소포(EV) 내에서 시작됩니다. 이 프로토콜은 쥐 대동맥에서 석회화를 획득 및 평가하고 관련 추출된 EV를 분석하는 방법을 설명합니다. 먼저, 마우스의 육안 절개를 수행하여 신장, 간 및 폐와 같은 관련 장기를 수집합니다. 그런 다음 쥐 대동맥을 분리하여 대동맥 뿌리에서 대퇴 동맥으로 절제합니다. 그런 다음 2-3개의 대동맥을 모아 소화액에서 배양한 후 초원심분리를 거쳐 관심 있는 EV를 분리합니다. 다음으로, 고인산염 용액에서 배양하고 파장 340nm에서 광흡광도를 측정하여 EV의 광물화 전위를 측정합니다. 마지막으로, 콜라겐 하이드로겔은 시험관 내에서 EV에 의해 생성된 석회화된 미네랄 형성 및 성숙을 관찰하는 데 사용됩니다.

서론

석회화는 심혈관 질환 사망률 및 이환율의 가장 중요한 예측 인자이다¹. 석회화는 칼슘과 인산염 미네랄의 축적으로 인해 동맥벽 역학을 변화시킵니다². 죽상동맥경화증에서 석회화는 국소 스트레스를 악화시키고 심장마비의 주요 원인인 플라크 파열을 유발할 수 있습니다. 종종 만성 신장 질환으로 인한 내측 석회화는 더 널리 퍼져 있으며 심각한 동맥 경화, 기능 장애 및 심장 과부하를 유발합니다 ^2,3. 현재 혈관 석회화의 치료 또는 예방을 위한 치료 옵션은 없습니다.

혈관 평활근 세포(VSMC)는 조골세포와 유사한 표현형을 채택하고 초기 미네랄을 핵화하는 석회화 세포외 소포(EV)를 방출하여 석회화를 유발합니다 ^4,5,6. 이 과정은 뼈⁷에서 조골 세포의 생리적 광물 화와 유사합니다. 광물화의 종점은 혈관벽과 뼈 기질에서 유사하지만, 석회화 EV가 발생하는 ....

프로토콜

생체 내 작업은 플로리다 국제 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인 및 감독을 받았으며 현재 NIH(National Institutes of Health) 지침을 준수했습니다. 이 프로토콜의 경우 절차는 마우스의 변형, 체중, 연령 및 성별에 따라 다르지 않습니다. 연구 중인 석회화의 유형, 식이 요법 및 치료법은 연구 기간과 사용된 마우스의 체중을 변경할 수 있으며 연구에 사용된 마우스의 특정 균주 및 성별에 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜을 위해 수컷과 암컷 C57BL/6J 마우스를 모두 사용하고 석회화 사료를 먹였습니다. 마우스를 20주령 내지 24주령 사이에 희생시켰다.

1. 대동맥의 격리 및 절제

1. 형광 마커
   1. 안락사 48시간 전에 정맥 주사를 통해 25g당 100μL의 권장 용량으로 형광 이미징제인 20μM OsteoSense 680을 마우스에 주사합니다.
   2. 흄 후드 아래에 4개의 t-핀이 있는 스티로폼 보드, 종이 타월을 깐 양동이, 종이 타월로 채워진 50mL 튜브, 1.5mL 미세 원심분리기 튜브, 해부 도구( 재료 표

결과

대동맥이 추출되면 근적외선 광학 스캐너를 사용한 영상은 대동맥과 혈관 석회화의 시각적 표현을 보여줍니다(그림 1). 스캔된 형광 이미지 내의 픽셀 강도 값은 석회화의 분포를 나타내며 여기에 컬러 히트맵을 사용하여 표시됩니다. 정량화 방법은 양성 역치를 식별하고, 이 역치보다 큰 값을 갖는 대동맥의 백분율 면적을 보고하고/하거나 대동맥 내 픽셀의 평균 형광 강도를 보고하는 것을 포함한다. 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 시판되는 일차 인간 관상동맥 평활근 세포를 사용하여 상기 기술을 시연하였다. VSMC의 컨디셔닝 배지를 사용하여 EV의 석회화 가능성을 측정할 수 있습니다. 시간 경과에 따른 미네랄 형성은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 480nm에서 광 흡광도로 측정됩니다(그림 2A, B

토론

프로토콜을 수행할 때 성공적인 결과를 얻기 위한 중요한 단계를 기록하는 것이 중요합니다. 쥐 대동맥을 분리하는 동안 관류가 제대로 수행되는 것이 중요합니다. PBS를 주사 할 때 우심실에 구멍이 뚫리지 않도록주의해야합니다. 이렇게 하면 액체가 심실에서 직접 누출되어 폐를 순환하지 못하여 대동맥 내에 혈액이 남게 됩니다. 관류가 제대로 수행되고 미세 해부가 시작되면 완료 및 스캔 전에 모든 지방 및 지방 조직을 대동맥에서 제거해야 합니다. 남은 지방은 데이터를 전체 조직 크기로 정규화할 때 대동맥이 더 크게 나타나게 합니다.

박리 중 마우스 대동맥의 크기가 제한되어 있기 때문에 대동맥을 뚫거나 반으로 자르는 것이 일반적입니다. 이 경우 평소와 같이 해부를 계속하는 것이 좋습니다. 대동맥 조각은 이미징을 위해 서로 가깝게 배치할 수 있습니다. 대동맥은 EV 격리를 위해 조각으로 소화액에 넣을 수도 있습니다. EV의 분리를 시작할 때 충분한 단백질을 생산하기 위해 여러 개의 대동맥이.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
8웰 챔버 커버 글라스	Thermo Scientific	155409PK
10 mL 주사기	BD	302995
20 G 1인치 니들	BD	305175
콜라겐, 고농도, 쥐꼬리	코닝	354249
콜라겐 분해 효소	Worthington Biochemical	LS004174
Curved Opportunityps	Roboz 수술 기구	RS-8254
해부 접시	생활 시스템 기구	DD-90-S
해부 팬 및 왁스	유나이티드 사이언티픽 용품	DSPA01-W
DMEM	Cytiva	SH30022. FS
Isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
LI-COR 오디세이	LI-COR	DLx
마이크로 해부 곡선 가위 (24mm 블레이드)	Roboz 수술 기구	RS-5913
마이크로 해부 스프링 가위(13mm 블레이드)	Roboz 수술 기구	RS-5677
마이크로 해부 스프링 가위(5mm 블레이드)	Roboz 수술 기구	RS-5600
마이크로 해부 핀셋(0.10 x 0.06mm 팁)	Roboz 수술 기구	RS-4976
Optima MAX-TL 초원심분리기	Beckman Coulter	B11229
OsteoSense 680EX	Perkin Elmer	NEV10020EX
Pierce 프로테아제 억제제	Thermo Scientific	A32963
염화칼	피셔 화학	P217
RIPA 용해 및 추출 버퍼	G Biosciences	786-489
염화나트륨	피셔 화학 물질	BP358
수산화나트륨	Thermo Scientific	A4782602
인산나트륨 일염기	Sigma-Aldrich	S0751
설탕	Sigma	S7903
Synergy HTX 멀티모드 리더	애질런트
조직 배양 플레이트, 96웰	Thermo Fisher	167008
T-핀	유나이티드 사이언티픽 용품	TPIN02-PK/100
트리스 하이드로클로라이드	피셔 케미컬	BP153

륨 성