방법 논문

Cell-Free 발현 시스템: 생산 및 사용 방법

393 조회수

⸱

2023년 7월 28일

 ,  , 
1US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3Office of Naval Research – Global

이 논문에서

초록

논의 된 기사 :

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE 무세포 시스템. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (172), doi:10.3791/62625 (2021).

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, JP cell-free autoinduction workflow를 사용하여 24시간 이내에 세포에서 cell-free 단백질 합성까지. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (173), doi:10.3791/62866 (2021).

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. 박테리아 무세포 용해물의 빠르고 저렴하며 복잡하지 않은 생산. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (176), doi:10.3791/62753 (2021).

Dopp, J. L., Reuel, N. F. cell-free 시스템을 사용하여 단백질 프로토타이핑을 위한 최소 선형 템플릿의 증폭을 위한 신속하고 효소적인 방법. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (172), doi:10.3791/62728 (2021).

McManus, JB et al. 무세포 시스템을 사용한 유전 부분의 신속한 특성화. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (174), doi:10.3791/62816 (2021).

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. 합성생물학 및 천연물 응용 분야를 위한 고수율 스트렙토마이세스 전사-번역 툴킷. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (175), doi:10.3791/63012 (2021).

Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. 용해물 기반 무세포 시스템에서 대사 산물 프로파일링을 위한 굴절률 또는 질량 분석 검출과 결합된 액체 크로마토그래피. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (175), doi:10.3791/62852 (2021).

Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. RNA 압타머 및 리보스위치를 암호화하는 DNA 플라스미드가 로드된 다기능 실크 기반 마이크로캡슐의 제조. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (176), doi:10.3791/62854 (2021).

Jaenes, K. et al. 종이 기반 발가락 스위치 진단의 개발 및 환자 검증을 위한 설계에서 구현까지의 연구. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (184), doi:10.3791/63223 (2022).

사설

무세포 발현(CFE) 시스템은 세포1의 경계 밖에서 전사, 번역 및 대사의 주요 세포 과정을 재구성하는 도구 모음입니다. 이러한 방법은 세포막 제거 를 통한 단순화된 실험과 게놈 DNA 제거 를 통한 복잡성 감소 및 유전적 구조와 숙주 간의 상호 작용의 복잡성을 제공함으로써 빠르게 인기가 높아졌습니다. CFE 시스템은 이제 기초 연구, 감지, 바이오 제조 및 교육에 사용됩니다. 이 방법 모음은 무세포 시스템을 생산하고 사용하는 새로운 방법의 9가지 예를 제시합니다.

세 가지 방법은 무세포 시스템 생산에 더 쉽게 접근할 수 있도록 하는 데 중점을 둡니다. Grasemann et al. 세포 용해물을 사용하는 대신 전사 및 번역에 필요한 모든 구성 요소를 재구성하는 CFE 시스템인 PURE 시스템을 만드는 더 쉬운 방법을 설명합니다2. 저자는 36가지 단백질 성분 각각을 발현하고 정제하는 대신 발현 균주를 모아 일주일 이내에 기능성 PURE 시스템을 생산합니다. Smith et al. 전체 작업 흐름을 24시간으로 단축하고 정상 근무 시간 내에 달성할 수 있는 간소화된 배양 접근 방식을 사용하여 용해물 기반 CFE 시스템 생산을 위한 단순화된 프로세스를 제공합니다3. Cooper et al. 동결-해동에 의한 세포 용해를 가능하게 하는 변형된 대장균 균주를 사용하여 다른 방법에 필요한 특수 장비가 필요하지 않은 방법을 설명합니다4. 이러한 모든 방법은 복잡한 기존 프로토콜에 대한 인프라와 전문 지식이 적은 실험실에서 무세포 시스템 생산을 달성할 수 있도록 하려는 노력의 추세에 기여합니다. 경쟁 상용 키트의 가용성으로 인해 점점 더 많은 실험실에서 위험이 거의 없이 CFE 시스템의 장점을 탐색할 수 있습니다. 여기에 제시된 것과 같은 방법을 사용하여 이러한 실험실은 장비나 시간에 막대한 투자 없이 필요에 맞는 자체 CFE 시스템을 만들 수 있습니다.

두 가지 방법은 CFE 시스템으로 가능한 신속하고 높은 처리량 실험의 이점에 중점을 둡니다. Doppet al. 유전적 구조의 신속한 스크리닝을 위해 선형 DNA 주형을 증폭하는 방법을 제시합니다5. 그들의 접근 방식을 사용하여 유전자 설계를 DNA 합성 회사에 주문한 다음 24시간 이내에 증폭 및 스크리닝할 수 있습니다. McManus et al. 리포터 유전자가 상이한 조절 성분을 암호화하는 다양한 프라이머로 증폭되는 유사한 접근법을 설명합니다6. CFE 시스템과 결합된 올리고의 저렴한 비용으로 프로모터와 같은 성분에 대한 신속하고 비용 효율적인 스크리닝이 가능합니다. 두 방법 모두 신속한 실험을 위한 CFE 시스템의 잠재력을 강조하여 기존 복제를 사용하여 구조물을 설계하고 테스트하는 데 걸리는 일정을 몇 주에서 며칠 또는 몇 시간으로 단축합니다.

다음 세 가지 방법은 CFE 시스템의 특수한 사용을 위한 도구를 제공합니다. Toh et al. Streptomyces venezuelae7에서 CFE 시스템을 생성하는 방법을 제공합니다. 대부분의 CFE 프로토콜은 이 컬렉션의 다른 모든 방법을 포함하여 대장균을 기반으로 합니다. S. venezuelae 에 대한 이 새로운 방법은 천연 제품 생산에 대한 광범위한 관심을 받는 유기체에 CFE 시스템의 이점을 제공합니다. Dinglasan et al. 무세포 반응에서 대사산물 농도를 측정하는 방법을 제공합니다8. 이러한 측정은 CFE 시스템의 온전한 대사가 관심 있는 비단백질 제품을 생산하는 데 사용되는 무세포 대사 공학의 응용 분야에 매우 중요합니다. 셋째, Drachuk et al. CFE 반응에 추가하기 위해 DNA의 마이크로캡슐화를 제시합니다9. 이 접근 방식은 CFE 시스템 제조 중에 천연 멤브레인을 제거한 후 구획화의 이점을 CFE 시스템에 합리적으로 다시 도입할 수 있는 일련의 기술을 대표합니다. 이러한 각 방법은 CFE 시스템을 적용할 수 있는 응용 분야의 범위를 다양화합니다.

마지막으로, Jaenes et al. CFE 시스템10을 기반으로 지카 바이러스에 대한 실제 진단을 생성하는 방법을 설명합니다. 테스트 및 계측은 PCR과 같은 경쟁 기술에 비해 비용이 저렴하며 저자는 여러 국가의 환자 샘플을 사용하여 진단을 성공적으로 테스트했습니다. 이 작업은 CFE 시스템이 실제 세계에서 가장 즉각적인 영향을 미칠 준비가 되어 있는 영역인 필요 지점 감지 애플리케이션의 강력한 예입니다.

모음집으로서 이러한 방법은 최근 몇 년 동안 CFE 시스템에서 활발히 진행되는 주요 연구 영역의 대표적인 영역을 포착합니다. CFE 시스템의 생산을 개선하고 높은 처리량 실험을 가능하게 하는 방법이 잘 설명되어 있으며 CFE 시스템의 보다 구체적인 용도에 대한 수많은 예가 있습니다. 다른 관심 분야로는 의료용 복합 단백질 생산, 비표준 아미노산 통합, 장기 보관 최적화, 인공 세포 개발 등이 있습니다. 우리는 진입 장벽 감소, 신속한 실험 가능성 및 더 넓은 범위의 기능을 고려할 때 CFE 시스템의 채택이 계속 가속화될 것으로 예상하며, 이 모든 것이 이 컬렉션에 제시된 것과 같은 방법을 통해 가능해졌습니다. 나머지 과제는 응용 분야에 따라 다릅니다. 바이오 제조의 경우 더 저렴한 기질로 전환하고 재활용을 개선하여 대규모 비용을 절감하는 것이 중요합니다. 감지의 경우 Jaenes et al.의 예를 기반으로 하는 중요한 작업이 필요합니다. 다양한 요구 시점 응용 분야에서 강력한 성능을 입증해야 합니다. 광범위하게 이 분야는 CFE 시스템으로 수행할 수 있는 일의 레퍼토리를 확장하는 동시에 핵심 기술을 지속적으로 개선해야 합니다.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 국방부 장관실의 S&T 우선순위 향상을 위한 응용 연구 프로그램이 이 컬렉션으로 이어진 협력을 지원한 것에 대해 감사를 표합니다.

참고문헌

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE cell-free system. Journal of Visualized Experiments. (172), e62625(2021).
  3. Smith, P. E. J., Slouka, T., Oza, J. P. From cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow. Journal of Visualized Experiments. (173), e62866(2021).
  4. Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate. Journal of Visualized Experiments. (176), e62753(2021).
  5. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-Free Systems. Journal of Visualized Experiments. (172), e62728(2021).
  6. McManus, J. B., et al. Rapid characterization of genetic parts with cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (174), e62816(2021).
  7. Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications. Journal of Visualized Experiments. (175), e63012(2021).
  8. Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based Cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (175), e62852(2021).
  9. Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with DNA plasmids encoding RNA aptamers and riboswitches. Journal of Visualized Experiments. (176), e62854(2021).
  10. Jaenes, K., et al. Design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics. Journal of Visualized Experiments. (184), e63223(2022).

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Protein SynthesisCell free AutoinductionBacterial Cell free LysateGenetic Parts CharacterizationSynthetic BiologyTranscription translation ToolkitMetabolite ProfilingSilk based MicrocapsulesRNA AptamersRiboswitchesDiagnostics

관련 논문