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근위축성 측삭 경화증(ALS)은 일생 동안 약 400명 중 1명에게 영향을 미치는 치명적인 신경퇴행성 질환입니다. 이 질병은 처음에는 상부 및 하부 운동 뉴런 장애로 나타나며 결국 증상발현 후 2-5년 이내에 호흡 부전의 결과로 마비 및 사망으로 진행됩니다 1. ALS는 유전적일 수 있으며 30개 이상의 다양한 유전적 돌연변이가 있지만 가족성 ALS의 약 55%를 차지하는 유전자 변이(C9orf72, FUS, SOD1, TARDBP)만이 있습니다. ALS 사례의 대부분인 약 90%는 산발성 ALS를 나타내며, 주요 원인은 아직 완전히 이해되지 않았습니다2. 적절한 도구와 모델 유기체를 사용하여 ALS의 메커니즘을 밝히는 것이 시급합니다. 이 방법 모음에서 우리는 이 질병을 모방하고 궁극적으로 치료 옵션을 찾는 측면에서 최근 연구 진행 상황에 대한 개요를 제공합니다. 예를 들어, 운동 뉴런 또는 성상세포로 분화될 수 있는 유도만능줄기세포(iPSC)의 적용은 인간화 모델 시스템(3,4,5)을 제공한다. 또한, 이 방법 모음에서는 생체 내에서 포도당 흡수 및 신경근 접합부(NMJ)를 연구하기 위한 초파리 6,7, 피질 뉴런을 연구하기 위한 마우스8, 운동 장애를 조사하기 위한 C. elegans 또는 제브라피쉬 9,10 및 사후 환자 조직11과 같은 동물 모델이 제시됩니다.
제브라피쉬 유충은 투명하고 운동 뉴런이 직접 보이기 때문에 비침습적 생체 내 연구를 위한 완벽한 도구입니다. Asakawa et al. 단일 척수 운동 뉴런에서 광유전학적으로 발현된 TDP-43의 상전이를 보여줍니다9. 조사 후 TDP-43의 세포질 재배치를 관찰하고 분석할 수 있습니다. 세포질 TDP-43의 응집은 ALS에서 퇴행성 운동 뉴런의 특징입니다. 이 방법을 사용하면 세포하, 시간적 방식으로 ALS 관련 단백질의 기능적 연구 및 분석이 가능합니다.
초고해상도 구조화 조명 현미경(SIM)을 사용하여 Coyne과 Rothstein은 핵을 분리하는 프로토콜을 자세히 설명하고 뉴클레오포린 복합체를 조사하는 방법을 설명합니다11. 뉴클레오포린 복합체는 약 30개의 서로 다른 뉴클레오포린 단백질(Nups)의 다중 사본으로 구성됩니다. 핵세포질 수송(NCT) 손상 및 Nup 변경은 ALS를 포함한 많은 신경퇴행성 질환의 초기 특징인 것으로 나타났습니다. 핵을 추출함으로써 NPC와 핵질 내의 개별 Nup 단백질을 3D로 조사할 수 있습니다. 흥미롭게도 이것은 iPSC 유래 세포뿐만 아니라 사후 조직에도 적용될 수 있습니다.
Currey와 Liachko는 ALS10의 C. elegans 모델에서 경증, 중등도 및 중증 운동 장애를 구별하기 위한 두 가지 분석을 설명합니다. 방사형 운동 분석에서는 표면의 크롤링을 측정하므로 쉽고 비용 효율적인 분석이 됩니다. 두 번째 방법인 수영 분석에서는 컴퓨터 기반 추적 방법을 사용하여 스래싱 동작을 측정할 수 있습니다. 저자는 이를 사용하여 TDP-43과 타우를 연구합니다.
Hayes et al. NCT8을 연구하는 방법도 설명합니다. 그들은 신경 배양에 투과화 방법을 적용합니다. 그들은 일차 마우스 피질 뉴런을 사용하여 소 혈청 알부민 쿠션과 결합된 저장성 용해를 사용하여 핵막 무결성을 유지하는 방법을 설명합니다. 이를 통해 원자력 수입은 여전히 에너지 의존적인 방식으로 기능하므로 고함량 현미경 및 분석 플랫폼을 제공합니다. 이 플랫폼은 향후 일차 뉴런의 수동 및 능동 핵 수송을 연구하는 데 광범위한 적용 가능성을 가질 것입니다.
조작, 질병 관련 단백질 또는 RNA가 시냅스 과정에 어떤 영향을 미치는지, 그리고 치료 약물이 이러한 기능을 회복할 수 있는지 여부에 대한 빠른 평가는 ALS 연구에 필수적입니다. iPSC 유래 운동 뉴런과 생쥐의 일차 뉴런을 사용하여 Krishnamurthy et al. 시냅스 전 칼슘 유입 역학 및 시냅스 소포막 융합을 실시간으로 모니터링할 수 있는 프로토콜을 제시합니다3. 저자는 C9orf72-(GA)50 형질감염이 시냅스 전달을 손상시킨다는 것을 입증하여 시냅스 기능의 돌연변이 기반 차이를 감지하기 위한 이러한 방법의 적합성을 강조합니다.
변화된 포도당 흡수는 ALS의 병리생물학적 특성 중 하나입니다. 이 초파리 모델에서, Loganathan et al. 특정 세포에서 포도당 흡수의 세포내 변화를 측정하는 FRET 기반 방법을 설명합니다6. 유전적으로 암호화된 포도당 FRET 센서를 사용하여 더 높은 포도당 흡수를 나타내는 TDP-43 발현 뉴런으로 방법을 검증합니다. TDP-43G298S 돌연변이 계통에서 증가된 포도당 흡수는 포도당 자극 시에만 감지될 수 있습니다. 이 방법은 ALS뿐만 아니라 일반적으로 운동 뉴런 재생과 관련하여 해당작용을 연구하는 데 중요한 도구를 제공합니다.
NMJ 구조를 보존하는 해부 기술은 시간이 지남에 따라 초파리 다리를 따라 운동 뉴런의 변화를 연구하는 데 가장 중요합니다. Stilwell과 Agudelo는 면역세포화학을 사용하여 운동 뉴런 아버를 식별하기 위해 NMJ의 특성화를 허용하는 기술을 활용합니다7. 흥미롭게도 성체 뉴런은 파리의 일생 동안 약 90일 동안 존재합니다. SOD1H71Y 돌연변이를 야생형과 비교하여 저자는 연령 의존적 부통 부종, 단백질 응집체 및 미토콘드리아 확대에 대한 다양한 마커를 보여줍니다.
공동 배양 시스템을 사용하여 NMJ를 모방하는 혁신은 운동 뉴런과 근관 사이의 해리를 연구해야 하는 긴급한 필요성을 충족시킵니다. 이 방법과 관련하여 Stoklund Dittlau et al. 인간 iPSC 유래 운동 뉴런 및 인간 일차 중혈관모세포 유래 근관을 배양하여 기능적으로 활성화된 NMJ를 형성하는 방법을 설명합니다4. 저자는 이후 NMJ 차단제 투여에 의해 폐지된 Fluo-4 표지 근관에서 염화칼륨과 칼슘 유입으로 운동 뉴런의 활성화에 의해 기능을 보여줍니다.
최근에는 공동 배양 시스템이 점점 더 주목을 받고 있습니다. 접시에서 하나뿐만 아니라 여러 세포 유형을 연구하면 단일 배양 세포를 사용하는 방법보다 생리학적 조건을 더 잘 모방할 수 있는 이점이 있습니다. 성상세포 매개 독성 및 신경 과흥분성과 같은 ALS 관련 병리생물학은 이 접근법을 사용하여 연구할 수 있습니다. Taga et al.의 비디오에서 다중 전극 어레이(MEA) 설정과 결합된 공동 배양에서 피질 뉴런 및 성상세포의 생성은 전기생리학 모니터링을 위해 표시됩니다5. 기능적 활성은 시간이 지남에 따라 모니터링할 수 있으며, 세포 구성과 다양한 배양 조건의 유연성을 허용합니다. 이는 약물의 치료 잠재력과 기능적 활동에 미치는 영향을 테스트할 수 있는 플랫폼을 추가로 제공합니다.
현재 ALS에 대해 FDA가 승인한 치료법은 세 가지뿐이며 모두 적용 가능성이 제한적입니다. 보다 유망한 치료법을 찾으려면 향후 연구에서 여러 모델 시스템과 접근 방식을 사용하여 병리생물학을 더 잘 이해해야 합니다. 의심할 여지 없이 인간 iPSC 유래 모델은 기본 분자 메커니즘을 조사할 수 있는 흥미로운 플랫폼을 제공할 것입니다. 이것은 제브라피쉬, C. elegans, 초파리 또는 설치류와 같은 모델 시스템과 결합되어 현장의 발전으로 이어질 것입니다. 또한, 향후 역학 연구는 환경 요인이 ALS12 발병에 어떤 역할을 하는지에 대한 더 많은 통찰력을 제공할 수 있기를 바랍니다. 확장되는 데이터 세트와 생물정보학이 빠른 속도로 발전함에 따라 향후 신경퇴행성 질환의 공통 분모를 밝히는 것이 더 쉬워질 것입니다. 이것은 치료 또는 예방을 위한 새로운 길로 이어질 것입니다.