Method Article

CryoEM 상태 업데이트 및 혁신적인 개발

DOI:

10.3791/65021

⸱

March 3rd, 2023

 ,  , 
1Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

논의 된 기사 :

Truong, C. D. et al. 전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 사용한 샘플 준비. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (177), e63015 (2021).

Johnson, M. C., Grant, A. J., Schmidt-Krey, I. 필 블롯 기법: 다층 또는 농축된 생물학적 시료에서 단일층을 분리하는 Cryo-EM 시료 전처리 방법입니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (184), e64099 (2022).

Chang, Y.-C., Chen, C.-Y., Tsai, M.-D. Cryo-EM을 위한 고온 시료 그리드 준비. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (173), e62772 (2021).

Kang, M.-H., Lee, M., Kang, S., Park, J. 고처리량 극저온 전자 현미경을 위한 두께가 제어된 마이크로 패턴 칩 제작. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (182), e63739 (2022).

Bieber, A., Capitanio, C., Wilfling, F., Plitzko, J., Erdmann, P. S. 고해상도 초저온 전자 단층 촬영을 위한 3D 상관 집속 이온 빔 밀링에 의한 시료 준비. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (176), e62886 (2021).

DiCecco, L.-A. et al. 액체와 얼음에서 바이러스 어셈블리의 고해상도 이미징 발전. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (185), e63856 (2022).

Kumar, A., P, S., Gulati, S., Dutta, S. 단일 입자 초저온 전자 현미경을 위한 사용자 친화적이고 처리량이 많으며 완전 자동화된 데이터 수집 소프트웨어입니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (173), e62832 (2021).

Discussion

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2017년 노벨상이 생체 분자의 극저온 전자 현미경(cryoEM)으로 수여되기 전에도 이 분야는 흥분을 불러일으켰습니다. 분해능 혁명은 순조롭게 진행되고 있었고 구조 생물학은 X선 결정학의 황금 표준에 접근하는 특성화 방법으로 cryoEM을 찾고 있었습니다1. 초기에 cryoEM 분야는 주로 cryo 투과 전자 현미경(cryoTEM)에서 생성된 데이터를 포함했습니다. 이제 현미경, 시료 전처리 기기, 시료 전처리 방법이 발전함에 따라 생성되는 데이터 유형이 더욱 다양해졌습니다. CryoEM은 더 이상 cryoTEM에 의한 단백질 특성 분석을 위해 예약되지 않습니다. 이 분야는 성장하여 현재 극저온 주사 전자 현미경과 집속 이온 빔(cryoSEM/FIB)에서 생성된 데이터로 구성되어 있습니다. 그 영향은 분자, 세포, 조직 및 하이드로겔과 같은 합성 물질에 대한 이미징 연구를 포함하여 여러 분야에서 더 광범위하게 느껴집니다.

이미징 기능의 발전은 cryoEM 개발의 원동력이 되었습니다. 카메라, 검출기 및 이미지 처리의 개선으로 더 적은 에너지 입력으로 이미징할 수 있는 길이 열렸고, 이를 통해 섬세한 생물학적 샘플이 이미징 과정에서 살아남을 수 있게 되었습니다. TEM에서 저선량 빔 노출은 단일 샘플을 여러 각도에서 반복적으로 이미지화하여 3D 재구성을 생성하는 단층 촬영의 적용으로 변환되었습니다 2,3. SEM/FIB의 발전으로 더 적은 에너지를 사용하면서 분해능도 향상되었습니다. 중요한 것은 이것이 비전도성 샘플의 이미징을 개선하여 SEM/FIB에서 더 나은 볼륨 이미징으로 변환된다는 것입니다 4,5. 이러한 개선은 모든 생물학적 전자 현미경 이미징을 발전시켰지만 특히 샘플이 섬세하고 대비를 개선하기 위해 추가 중금속이 첨가되지 않은 극저온 이미징을 개선했습니다.

이미징 기능이 발전함에 따라 시료 준비 장비도 발전했습니다. cryoEM 시료 전처리에서 첫 번째 단계는 시료를 성공적으로 유리화하는 것입니다. 수화된 샘플은 얼어붙어 비정질 얼음을 형성하므로 얼음 결정 형성으로 인한 손상을 방지할 수 있습니다. 주요 전략은 분자 및 소형 셀의 경우 액체 에탄에서 급속 냉동 또는 최대 수백 미크론 두께의 대형 샘플에 대한 고압 냉동(HPF)입니다. 급락형 냉동 기술의 발전으로 공기/물 계면을 따라 자체 조립을 줄임으로써 모든 방향에서 분자를 더 잘 포획할 수 있습니다6. 또한 HPF 기술의 발전으로 얼기 전 순간에 샘플의 빛과 전기적 자극이 가능해졌습니다7. 가장 최근에는 형광 현미경과 인터페이스할 수 있는 새로운 HPF 기술이 개발되어 살아있는 세포의 형광 이미징과 HPF 동결 사이에 짧은 시간 지연(<2초)이가능합니다8.

위의 발전은 cryoEM 분야에 활력을 불어넣고 새로운 방법의 개발에 영감을 주었습니다. 기존 기술에 대한 재활성화도 있었습니다. 여기에서는 이러한 전략을 빠르게 확장되는 연구 분야에 전파하기 위해 cryoEM을 발전시키는 데 초점을 맞춘 방법 모음을 제시합니다.

이미징 기능과 시료 전처리 장비의 개선이 cryoEM 분야 발전의 주요 원동력이었지만, 이 연구의 주요 장애물은 계속해서 시료를 직접 준비하는 것입니다. Truong et al.9 은 공기/물 계면에서 지질 단층 형성을 활용하는 방법을 제시합니다. 지질층은 TEM 그리드에 형성되고 관심 있는 막 단백질의 스캐폴드 역할을 합니다. 다층 또는 적층 멤브레인 샘플의 경우 Johnson et al.10 은 TEM 이미징에 적합한 단일 층을 그리드에 남겨두고 초과 층을 "벗겨내는" 전략을 제시합니다. 또 다른 논문에서 Chang et al.11 은 일부 단백질이 온도에 의존적이며 관련 구조가 고온에서 관찰된다는 것을 인식합니다. 그들은 급락 냉동 후에도 유리체 얼음을 얻으면서 고온에서 샘플을 그리드에 적용할 수 있는 수정된 급락형 냉동 방법을 설명합니다. 극저온 그리드 준비 과정을 추가로 제어하기 위해 Kang et al.12 는 기공이 제어 가능한 깊이를 갖는 TEM 그리드용 마이크로패턴 칩을 생산하는 고처리량 방법을 제시합니다. 이 방법은 그리드 준비 중에 비정질 얼음의 두께를 제어하기 위한 또 다른 변수를 제공할 수 있습니다.

여러 이미징 양식의 상관관계는 영향을 미칩니다. Bieber et al.13 은 관심 있는 형광 영역을 찾기 위해 냉동 형광 현미경에서 얼어붙은 그리드를 이미지화하는 극저온 워크플로를 설명합니다. 그런 다음 그리드는 cryoSEM/FIB로 전송되며, 여기서 기준점은 형광 이미지를 SEM 이미지와 정렬하는 데 사용되므로 형광 영역을 FIB 밀링의 대상이 될 수 있습니다. 표적 영역을 수백 나노미터로 얇게 만든 다음 그리드를 얇아진 표적 위치에서 단층 촬영을 위해 cryoTEM으로 옮깁니다. DiCecco et al.14 는 액체 TEM과 cryoTEM 사이의 상관관계를 입증하여 고해상도 cryoTEM 데이터를 동적 운동 중인 분자의 TEM 데이터와 결합하는 목표에 더 가까워졌습니다.

대규모 데이터 세트의 자동 수집도 관심 분야입니다. 귀중한 기기 시간을 최대화해야 하며 자동화가 핵심 단계입니다. Kumar et al.15 는 cryoTEM 이미징을 위한 자동화된 데이터 수집 소프트웨어의 클릭별 설정을 설명합니다.

cryoEM 분야가 계속 발전함에 따라 샘플 준비에서 더 많은 발전이 이루어질 것이며 cryoEM의 영향은 더 많은 분야에서 광범위하게 느껴질 것입니다. 일부 발전에는 새로운 기술이 아니라 기존 기술의 강화가 포함될 것입니다. 이 기술은 더 빠르고 쉽고 강력하며 처리량도 더 높습니다. 자동화로 인해 데이터 출력이 증가함에 따라 주요 개발 영역은 이미지 분석 및 데이터 처리가 될 것입니다. 또한 AI가 중요한 역할을 할 것입니다. 계측 비용과 설치 공간이 감소하여 이러한 개발이 실현되는 속도가 느릴 수 있지만 이 기술에 더 광범위하게 접근할 수 있을 것으로 예상해야 합니다.

Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 컬렉션에 기여한 모든 저자와 이 분야에서 지속적인 발전에 대해 동료들에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립암연구소(National Cancer Institute)의 코흐 연구소 지원(핵심) 보조금 P30-CA14051의 일부 지원을 받았습니다. 기술 지원을 해주신 Koch Institute의 Robert A. Swanson(1969) 생명공학 센터, 특히 Peterson(1957) Nanotechnology Materials Core Facility에 감사드립니다.

References

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  9. Truong, C. D., et al. Sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies. Journal of Visualized Experiments. (177), e63015(2021).
  10. Johnson, M. C., Grant, A. J., Schmidt-Krey, I. The peel-blot technique: A cryo-EM sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples. Journal of Visualized Experiments. (184), e64099(2022).
  11. Chang, Y. -C., Chen, C. -Y., Tsai, M. -D. Preparation of high-temperature sample grids for cryo-EM. Journal of Visualized Experiments. (173), e62772(2021).
  12. Kang, M. -H., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabrication of micro-patterned chip with controlled thickness for high-throughput cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (182), e63739(2022).
  13. Bieber, A., Capitanio, C., Wilfling, F., Plitzko, J., Erdmann, P. S. Sample preparation by 3D-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments. (176), e62886(2021).
  14. DiCecco, L. -A., et al. Advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice. Journal of Visualized Experiments. (185), e63856(2022).
  15. Kumar, A., P, S., Gulati, S., Dutta, S. User-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (173), e62832(2021).

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