방법 논문

글리코겐 대사 연구 방법

DOI:

10.3791/65023

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2023년 3월 3일

1Indiana University School of Medicine-Muncie and Ball State University

이 논문에서

초록

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논의 된 기사 :

Wilson, W. A. 진핵 생물 글리코겐 대사 연구를 위한 분광 광도법 방법. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (174), e63046 (2021).

Wang, J. J. 외. 박테리아 글리코겐 입자의 분자 구조 특성화를 위한 비분해성 추출 방법. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (180), e63016 (2022).

Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. 글리코겐 구조 측정을 위한 간 글리코겐 분자 추출. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (180), e63088 (2022).

Jensen, R., Ortenblad, N., di Benedetto, C., Qvortrup, K., Nielsen, J. 투과 전자 현미경을 사용한 골격근 섬유의 세포 내 글리코겐 분포 정량화. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (180), e63347 (2022).

Fermont, L., Szydlowski, N., Colleoni, C. 형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE) 방법을 사용한 글리코겐의 글루칸 사슬 길이 분포 측정. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (181), e63392 (2022).

사설

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분지형 포도당 중합체인 글리코겐은 원핵생물과 진핵생물의 에너지 대사에 중요한 역할을 합니다. 영양 제한 조건에서 박테리아와 효모는 세포 생존을 위해 글리코겐을 활용합니다1. 포유류에서 글리코겐은 수축을 촉진하기 위해 근육에서 국소적으로 사용하고 혈당 수치를 조절하기 위해 간에서 국소적으로 사용하는 것을 포함하여 조직 특이적 역할을 합니다2. 글리코겐의 합성은 알파 1,4 결합 을 통해 포도당 잔기를 결합하는 글리코겐 합성효소와 알파 1,6 결합을 형성하여 글리코겐 고분자에 가지를 생성하는 분지 효소에 의해 촉매됩니다. 이 에너지 저장의 활용은 분지 제거 효소와 함께 글리코겐 포스포릴라아제에 의해 촉진되어 글리코겐의 리모델링과 포도당-1-P의 방출을 초래합니다. 입자 크기와 분지를 포함한 글리코겐의 구조는 분기가 글리코겐 용해도에 영향을 미치고, 글리코겐 입자의 크기가 분해 속도에 영향을 미치며, 글리코겐 구조 불안정성이 당뇨병과 관련이 있기 때문에 부분적으로 관심이 있습니다. 또한, 글리코겐의 세포내 국소화를 조사하는 것은 운동 중 이 연료의 역할에 대한 정보를 얻기 위해 근육과 같은 조직에서 중요합니다.

글리코겐의 축적은 글리코겐 합성 효소와 거대분자를 분해하는 효소의 상대적 활성에 의해 제어됩니다. Wilson3 은 글리코겐 합성효소, 글리코겐 포스포릴라제, 분지 효소 및 탈분지 효소의 효소 활성을 측정하는 기술을 설명합니다. 이러한 생화학적 방법은 분광 광도계를 사용하여 NADH/NADPH 또는 비색 변화의 생성 또는 소비를 측정합니다. 이는 방사성 동위원소를 활용하는 보다 민감한 방법과 관련된 높은 비용, 특수 장비 및 규제 부담을 우회하는 확장 가능한 접근 방식입니다. 설명된 방법은 정제된 효소로 효소 활성을 측정하는 데 가장 적합하지만, 충분한 균질액 희석과 적절한 대조군을 통해 조직 샘플에 사용되었습니다. Wilson3 은 또한 글리코겐 분기를 측정하기 위한 간단한 비색 분석을 설명합니다. 이 방법은 더 힘든 분리 기술보다 글리코겐의 미세 구조에 대한 정보가 적지만 분지의 상대적 정도에 대한 간단하고 빠른 측정을 제공합니다.

Fermont et al.4 는 글리코겐 입자 크기와 분지 비율을 반영하는 사슬 길이 분포(CLD)를 결정하는 방법인 형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE)의 사용을 설명합니다. 글리코겐의 구조는 박테리아가 기아에서 생존하는 능력에 영향을 미치며, 비정상적인 글리코겐은 여러 글리코겐 축적 질환에 축적되므로 이 연료원의 크기와 분기를 연구하는 방법의 중요성이 강조됩니다. FACE는 8-아미노 1,3,6 피렌 트리설폰산(APTS)을 갖는 헤미아세탈 그룹의 환원 아미노화를 포함합니다. CLD에 대한 정보를 제공하는 것 외에도 FACE는 다양한 소스에서 분지 효소의 촉매 특성을 측정하는 데 유용합니다. 주요 경쟁 기술인 HPAEC-PAD는 비환원 말단이 필요하지 않다는 장점이 있지만 이 기술에는 질량 바이어스 문제가 있습니다.

분지 정도와 글리코겐 입자의 크기는 모두 포도당 중합체의 중요한 특성입니다. 전자 현미경을 사용하여 글리코겐이 여러 개의 감마 입자(3nm)를 포함하는 구형 베타 입자(~20nm)와 베타 입자로 구성된 더 큰 로제트 모양의 알파 입자(~300nm)의 세 가지 구조로 존재하는 것으로 관찰되었습니다5. 글리코겐을 분리하는 전통적인 방법은 글리코겐 농도를 측정하는 데 충분하지만 글리코겐의 미세한 구조를 손상시키므로 더 온화한 기술의 개발이 필요합니다. 자당 밀도 구배 원심분리를 사용한 냉수 추출은 Wang, Wang et al.6에 의해 박테리아에 사용하기 위해 설명되었습니다. 이 기술은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 측정한 더 큰 글리코겐 분자와 형광단 보조 모세관 전기영동(FACE)6으로 측정한 더 긴 사슬을 모두 보존하는 데 있어 다른 방법보다 우수합니다. Wang, Liu et al.7 도 간에도 유사한 방법을 적용합니다. 글리코겐 구조를 이해하는 것의 중요성은 당뇨병에서 간 글리코겐 알파 입자가 "깨지기 쉬운" 것이므로 안정적인 알파 입자에 비해 더 빨리 분해되어 혈당 조절에 영향을 미칠 수 있음을 보여주는 최근 보고서에 의해 입증됩니다. 이러한 자당 구배 기반 분리 방법의 한계에는 더 낮은 자당 농도로 완화될 수 있는 상청액에서 글리코겐의 손실과 사용된 온화한 조건으로 인한 글리코겐 일부의 효소 분해가 포함됩니다. 후자는 짧은 끓는 단계에 의해 완화되지만 이는 관련 단백질을 파괴합니다.

마지막으로 Jensen et al.8 은 단일 골격근 섬유에서 글리코겐 세포내 분포 및 입자 크기를 이미지화하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 근막하, 근원섬유 및 근원섬유내 글리코겐 풀을 조사하는 데 사용할 수 있는 유일한 방법이며 다양한 동물의 근육 조직에 사용되었습니다. 일부 세포 내 과정은 글리코겐을 연료로 우선적으로 활용하기 때문에 이러한 연료 저장고의 위치를 특성화하는 것이 중요합니다. 또한, 이 방법은 피로가 선택된 섬유에서만 글리코겐에 의존하는 운동에서 중요한 독특한 근섬유 유형의 글리코겐 대사를 검사할 수 있는 능력을 제공합니다. TEM 방법의 한 가지 한계는 작은 글리코겐 입자를 검출할 수 없다는 것이며, 이는 특히 근육 수축 중과 같이 글리코겐이 분해되는 조건에서 우려되는 문제입니다.

결론적으로, 이 방법 모음은 글리코겐의 구조와 이 거대분자의 동화 작용 및 이화 작용을 조절하는 효소를 조사하는 데 사용되는 기술 샘플을 제공합니다. 이러한 방법은 생리학적 및 병리학적 상태 모두에서 글리코겐 대사에 대한 이해를 향상시키는 데 중요한 역할을 할 것입니다.

공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 감사의 말이 없습니다.

참고문헌

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  1. Wilson, W. A., et al. Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).
  2. Pederson, B. A. Mammalian Glycogen Metabolism: Enzymology, Regulation, and Animal Models of Dysregulated Glycogen Metabolism. Enzymology of Complex Alpha-Glucans. , CRC Press. Baca Raton. First edition 84-137 (2021).
  3. Wilson, W. A. Spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism. Journal of Visualized Experiments. (174), e63046(2021).
  4. Fermont, L., Szydlowski, N., Colleoni, C. Determination of glucan chain length distribution of glycogen using the fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) method. Journal of Visualized Experiments. (181), e63392(2022).
  5. Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
  6. Wang, J. J., et al. A non-degradative extraction method for molecular structure characterization of bacterial glycogen particles. Journal of Visualized Experiments. (180), e63016(2022).
  7. Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. The extraction of liver glycogen molecules for glycogen structure determination. Journal of Visualized Experiments. (180), e63088(2022).
  8. Jensen, R., Ortenblad, N., di Benedetto, C., Qvortrup, K., Nielsen, J. Quantification of subcellular glycogen distribution in skeletal muscle fibers using transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e63347(2022).

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Spectrophotometric MethodsBacterial Glycogen ParticlesLiver Glycogen ExtractionGlycogen Structure DeterminationSubcellular Glycogen DistributionSkeletal Muscle FibersTransmission Electron MicroscopyGlucan Chain Length DistributionFluorophore assisted Carbohydrate Electrophoresis

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