이온 트랩 질량분석법 및 다단계 단편화 분석을 사용한 티베트 의학의 화합물 구조 표준화

요약

여기에서 우리는 티베트 의학의 복잡한 천연물 제형(매트릭스)에서 미량과 미량 성분을 식별하는 데 적용할 수 있는 일반적인 프로토콜과 디자인을 설명합니다.

초록

티베트 의약품은 복잡하고 알려지지 않은 수많은 화합물을 포함하고 있어 분자 구조에 대한 심층 연구가 중요합니다. 액체 크로마토그래피-전기분무 이온화 비행 시간 질량 분석법(LC-ESI-TOF-MS)은 일반적으로 티베트 의약품을 추출하는 데 사용됩니다. 그러나 스펙트럼 데이터베이스를 사용한 후에도 예측할 수 없는 많은 알려지지 않은 화합물이 남아 있습니다. 본 논문은 이온 트랩 질량 분석법(IT-MS)을 사용하여 티베트 의학의 성분을 식별하는 보편적인 방법을 개발했습니다. 이 분석법에는 시료 전처리, MS 세팅, LC 프리런, 분석법 확립, MS 획득, 다단계 MS 작동 및 수동 데이터 분석을 위한 표준화되고 프로그래밍된 프로토콜이 포함됩니다. 티베트 의약 Abelmoschus manihot 종자의 두 가지 대표적인 화합물은 전형적인 화합물 구조에 대한 상세한 분석과 함께 다단계 단편화를 사용하여 확인되었습니다. 또한 이 기사에서는 이온 모드 선택, 이동상 조정, 스캔 범위 최적화, 충돌 에너지 제어, 충돌 모드 전환, 단편화 요인 및 방법의 한계와 같은 측면에 대해 설명합니다. 개발 된 표준화 된 분석 방법은 보편적이며 티베트 의학에서 알려지지 않은 화합물에 적용 할 수 있습니다.

서론

중국 전통 의학(TCM)에서 미량 성분의 정성 분석은 연구에서 중요한 주제가 되었습니다. TCM에는 화합물의 수가 많기 때문에 핵자기 공명 분광계(NMR) 또는 X선 회절계(XRD) 분석을 위해 이들을 분리하기가 어렵기 때문에 적은 양의 시료만 필요한 질량 분석법(MS) 기반 방법이 점점 인기를 얻고 있습니다. 또한, MS와 결합된 액체 크로마토그래피(LC)는 복잡한 시료의 분리 및 화합물의 정성 분석을 개선하기 위해 최근 몇 년 동안 TCM 연구에서 널리 사용되었습니다¹. 한 가지 일반적인 방법은 액체 크로마토그래피-전기분무 이온화 비행 시간 질량분석법(LC-ESI-TOF-MS)으로, 티베트 의학에 대한 질적 연구에 널리 사용된다². 이 방법을 사용하면 복잡한 성분이 LC 컬럼에서 농축 및 분리되고 MS 검출기를 사용하여 부가물 이온의 질량 대 전하 비율(m/z)을 관찰할 수 있습니다. 탠덤 MS(MS/MS 또는 MS²) 데이터베이스 검색은 현재 Quadrupole Time-of-Flight(Q-TOF) MS 및 Orbitrap MS³을 사용한 소분자 분석에서 신뢰할 수 있는 화합물 주석을 위한 가장 빠른 접근 방식입니다. 그러나 데이터베이스의 품질이 좋지 않고 다양한 이성질체가 존재하기 때문에 알려지지 않은 화합물의 식별이 방해를 받습니다. 또한, MS/MS 데이터베이스에 의해 제공되는 정보는^{제한된다(4,5,6,7}). 다른 TCM에 널리 적용될 수 있는 일반적인 프로토콜을 사용하여 각 TCM의 화합물을 조사하는 것이 중요합니다.

IT-MS는 링 전극(⁸)에 상이한 무선 주파수(RF) 전압을 인가함으로써 광범위한 이온을 포획한다. IT-MS는 다양한 연대순으로 시계열 다단계 MS 스캔을 수행하여 성분 다단계 MS(MS n) 단편화를 제공할 수 있으며, 여기서ⁿ은 생성 이온 단계⁹의 수입니다. 선형 IT-MS는 순차적 MSⁿ 실험에 사용될 수 있기 때문에 구조 식별에 가장 적합한 것으로 간주됩니다¹⁰. 표적 이온은 선형 IT-MS¹에서 분리 및 축적될 수 있습니다. IT-MS의 MS n(ⁿ ≥ 3)은 Q-TOF-MS의 MS/MS보다 더 많은 단편 정보를 제공한다. IT-MS는 표적 이온과 그 단편 이온을 잠글 수 없기 때문에 이성질체¹을 포함한 미지의 화합물의 구조 규명을 위한 강력한 도구입니다. MSⁿ 기술은 미지의 단백질, 펩타이드 및 다당류의 구조 분석에 널리 적용되어 왔다^11,12. MSⁿ의 단편 이온의 풍부도 수준은 Q-TOF-MS의 MS/MS보다 복잡한 샘플의 표적 화합물에 대한 더 많은 분자 단편 정보를 제공합니다. 따라서 TCM의 구조 식별에 MSⁿ 기술을 적용하는 것이 필수적입니다.

티베트 의학은 TCM¹³의 중요한 구성 요소이며, 이러한 의약품은 주로 고원 지역¹⁴에서 발견되는 동물, 식물 및 광물에서 파생됩니다. 티베트 약인 Abelmoschus manihot seeds (AMS)는 Abelmoschus manihot (linn.) medicus의 씨앗입니다. AMS는 아토피 피부염, 류머티즘 및 나병과 같은 상태를 치료하는 데 사용되는 전통 약초입니다. 항균, 항진균, 항암, 항산화, 항염 효과가 있는 칼콘이 함유되어 있다¹⁵. 본 연구에서는 MS n 절차를 개선하고, IT-MS 및 MSⁿ을 이용하여 티베트 의약 AMS의 화합물 구조를 규명하기 위한 상세한 방법을 개발하였다. 이온 모드, 스캐닝 범위 및 충돌 모드를 포함한 특정 MS 파라미터는 미량 화합물 식별 문제를 극복하기 위해 최적화되었습니다. 이 연구는 TCM에서 미량 화합물의 표준화된 구조 식별을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

1. 시료 전처리

1. AMS 샘플 1g을 정확하게 칭량하고 80% 메탄올 30mL와 함께 원뿔형 플라스크에 넣습니다. 혼합물을 초음파 수조 초음파 처리기로 옮겨 25°C에서 30분 동안 추출한다. 샘플을 14,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
   참고: 초음파 수조 초음파 처리기의 주파수는 40KHz입니다.
2. 주입 주사기와 미세 다공성 멤브레인 필터(0.22μm, 유기물만 해당)를 준비합니다. 상청액을 2mL 샘플 병으로 여과합니다.

2. MS 설정

1. 진공 펌프의 스위치를 켭니다. 아르곤 실린더의 메인 밸브와 분압 밸브를 열고 압력을 약 0.3MPa로 조정합니다. 질소 밸브를 엽니다.
   알림: 실험 조건에 충분한 진공도를 보장하기 위해 최소 8시간 동안 기다리십시오. 분석하기 전에 아르곤과 질소의 가스 압력이 충분히 높은지 확인하십시오.
2. MS 제어 소프트웨어를 실행합니다. 소프트웨어 패널에서 가열된 SEI 소스를 클릭하고 히터 온도(350°C), 피복 가스 유량(35arb), 보조 가스 유량(15arb), 스프레이 전압(포지티브 모드의 경우 3.8KV, 네거티브 모드의 경우 -2.5KV) 및 모세관 온도(275°C). Apply(적용 ) 버튼을 클릭하여 이온 소스를 활성화합니다.

3. LC prerun, 분석법 수립 및 MS 획득

1. 이동상 A와 이동상 B는 각각 0.1% 포름산 수용액과 순수한 아세토니트릴을 사용하여 준비합니다. 초음파 수조 초음파 처리기에서 최소 15분 동안 가스를 제거합니다. 용액을 각각 A 및 B 유체 통로에 연결합니다(그림 1A). 메탄올-물(1:9 v/v) 용액을 준비한 다음 펌프와 인젝터의 세척액에 손으로 채웁니다.
   참고: 초음파 수조 초음파 처리기의 주파수는 40KHz입니다.
2. LC-MS 제어 소프트웨어를 실행합니다.
   1. 직접 제어 버튼을 클릭하여 LC 제어판을 엽니다. 펌프 모듈에서 시계 반대 방향으로 퍼지 밸브를 엽니다(그림 1B).
   2. 추가 옵션 버튼을 클릭하여 펌프 설정을 열고 퍼지 매개변수를 ^5mLmin-1에서 3분 동안 설정합니다. 제거 버튼을 클릭하여 거품 제거를 시작합니다. 그런 다음 퍼지 밸브를 닫습니다.
3. Prime Syringe, Wash Buffer Loop 및 Wash Needle Externally 버튼을 클릭하여 주사기를 각각 3주기 동안, 루프를 1주기 동안, 바늘을 1주기 동안 헹굽니다. 샘플 병을 샘플러에 넣습니다(그림 1C).
4. 기기 설정 버튼을 클릭하여 분석법 편집 창을 엽니다. 새로 만들기(New) 버튼을 클릭하여 새로운 LC-MS 기기 분석법을 생성합니다.
5. LC 방법에 대한 총 실행 시간을 설정합니다. 그런 다음 분석법 편집 창에서 압력 한계, 총 유량, 유량 구배, 시료 온도, 컬럼 온도 및 준비 온도 델타를 설정하는 값을 입력합니다.
   참고: 이동상의 기본 총 유속은 크로마토그래피 컬럼이 없는 경우 컬럼 온도가 50% A 및 50%B인 경우 0.3mL/분으로 일정합니다. 샘플 온도 및 준비 온도 델타의 기본값은 각각 15°C 및 0.1°C입니다. 다른 설정은 사용되는 액체 크로마토그래피 컬럼의 유형에 따라 다릅니다.
6. MS 방법에 대해 일반 MS 또는 MSⁿ 실험 유형을 선택합니다. 값을 입력하여 획득 시간, 극성, 질량 범위, 전환 값 번호 및 전환 값 지속 시간을 구성합니다. Save(저장 ) 버튼을 클릭하여 설정을 기기 방법으로 구성합니다.
   참고: 크로마토그래피 컬럼이 없는 기본 설정은 다음과 같습니다: 획득 시간, 2분; 극성, 양극 또는 음극; 질량 범위, 100 내지 1,200; 스위치 값 번호, 2; 및 전환 값 지속 시간, 1.99분.

4. 다단계 질량분석법 운영

1. 시퀀스 설정(Sequence Setup) 버튼을 클릭하여 시퀀스 테이블을 엽니다.
   1. 표에 샘플 유형, 파일 이름, 경로, 샘플 ID, 기기 방법, 위치 및 주입 부피 정보를 입력합니다.
   2. Save(저장) 버튼을 클릭하여 시퀀스 테이블을 기록한 다음 Start Analysis(분석 시작) 버튼을 클릭하여 설정을 구현하고 MS 수집을 시작합니다.
      참고: 기본 샘플 유형은 알 수 없음으로 선택됩니다. Instrument Method는 3.6단계에서 저장한 Method입니다. 샘플 병은 샘플 룸의 고유한 위치에 배치됩니다. 예를 들어, RA1 은 샘플 룸에서 빨간색 영역의 첫 번째 행에 있는 첫 번째 위치입니다. 기본 주입 부피는 일반적으로 2μL이며, 이는 시료의 농도에 따라 다릅니다.
2. 탐색기에서 원시 파일을 두 번 클릭하여 MS 데이터를 데이터 처리 소프트웨어에로드합니다. 기본 피크 크로마토그램(BPI)에서 마우스를 클릭하고 드래그하여 곡선 아래 최대 면적(AUC)이 있는 영역을 선택합니다. 해당 MS 스펙트럼이 동일한 창에 표시됩니다.
3. 다음 MS/MS 분석을 위한 표적 이온을 선택합니다.
   1. 메서드 편집 창을 다시 엽니다. MSⁿ 설정 테이블에서 대상 이온의 m/z를 Parent Mass 열의 소수점 이하 한 자리로 설정합니다.
   2. 충돌 모드(Collision mode)를 선택하고 충돌 에너지(CE) 값을 입력합니다. MS/MS 스캔 범위를 설정합니다. 저장 버튼을 클릭하여 MS 분석법을 기록하고 시퀀스 테이블에 새 파일 이름을 입력합니다. 시작 버튼을 클릭하여 MS/MS 수집을 시작합니다.
      참고: MS/MS 스캔 범위는 표적 모이온의 40%-130%였습니다. CID(Collision-Induced Dissociation) 모드의 기본 CE 값은 35%입니다.
4. 탐색기에서 원시 파일을 두 번 클릭하여 MS/MS 원시 파일을 데이터 처리 소프트웨어에 로드합니다.
   1. MS/MS 스펙트럼에서 가장 강한 단편 이온을 식별하고 m/z 값을 MSⁿ 분석법 목록에 입력합니다. MS ⁿ Setting 테이블에서 충돌 모드, CE 값 및 스캔 범위를 포함한 MS³ 매개변수를 설정합니다.
   2. 저장 버튼을 클릭하여 MS 분석법을 기록하고 시퀀스 테이블에 새 파일 이름을 입력합니다. 시작 버튼을 클릭하여 MS³ 획득을 시작합니다.
5. 탐색기에서 원시 파일을 두 번 클릭하여 MS³ 원시 파일을 데이터 처리 소프트웨어에로드합니다. 단계 4.4를 반복하여 MS⁴ 스펙트럼을 얻습니다.
6. 스펙트럼에서 안정한 단편 이온이 관찰되지 않을 때 MSⁿ 실험을 완료한다.

5. 수동 MSⁿ 데이터 분석

1. 원시 파일을 두 번 클릭하여 MS에서 MSⁿ까지의 모든 질량 스펙트럼을 엽니다. 이온과 해당 단편 이온 사이의 m/z 차이 값을 수동으로 계산합니다.
   참고: 예를 들어, 이온(m/z 617.25)과 해당 단편 이온(m/z 571.28) 사이의 m/z 차이 값은 MS/MS에서 45.97이었고, 이온(m/z 571.28)과 해당 단편 이온(m/z 525.38) 사이의 m/z 차이 값은 MS³에서 45.90이었고, 이온(m/z 525.38)과 해당 단편 이온(m/z 344.93 및 273.16) 사이의 m/z 차이 값은 180.45이고 MS 252.22에서 각각⁴.
2. MS⁴ 결과(MSⁿ의 마지막 레벨)에 따라 "코어" 구조를 수동으로 그립니다. m/z 차이 값을 기반으로 작용기 또는 분자 세그먼트를 사용하여 원래 구조를 수동으로 도출합니다. MSⁿ에서 각 분자 구조에 따라 분자 절단 경로를 수동으로 그립니다. 수동 분자 유도의 예는 대표적인 결과 섹션에 자세히 설명되어 있습니다.

결과

셀로비오스는 양이온 모드에서 MSⁿ의 타당성을 검증하기 위한 모델로 사용되었다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이 셀로비오스[C12H22O11]+의 ESI-MS(양이온 모드)는 m/z 365에서 양성자화된 분자[M+H]⁺를 생성했습니다. m/z 365에서 [M+H]⁺의 생성물 이온 스캔(CID-MS/MS)은 m/z 305에서 두 번째 단편 이온을 생성했으며(그림 2B), MS³ 및 MS⁴ 분석을 사용하여 추가로 분석되었습니다(그림 2C, D). MS³ 분석은 m/z 254에서 세 번째 단편 이온을 생성했고, MS⁴ 분석은 m/z 18...

토론

IT-MS와 MSⁿ 기술은 미량 TCM 화합물의 구조를 식별하는 새로운 접근 방식을 제공합니다. 단편 이온을 깊이 식별할 수 없는 Q-TOF-MS와 달리 MSⁿ 기술이 적용된 IT-MS는 이온을 분리하고 축적하는 능력으로 인해 탁월합니다. 이 기사에서는 IT-MS 및 MSⁿ 기술을 사용하여 티베트 의학에서 미량 화합물을 식별하는 방법을 간략하게 설명합니다. 상기 방법은 제공된 단편 이온 정보의 양을 결정하기 위해 MS n의ⁿ 값을 이용한다. 이 방법의 중요한 단계에는 적절한 스캔 범위를 선택하고 CE 값을 조정하여 귀중한 조각을 식별하는 것이 포함됩니다.

일반적으로 당류의 MSⁿ 분석은 양이온 모드¹⁶에서 가장 잘 수행되는 반면, 페놀산 및 알칼로이드는 음이온 모드에서 가장 잘 분석됩니다. ESI 공급원에서 화합물의 반응은 포름산, 아세트산...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Acetonitrile	Thermo Scientific	CAS 75-05-8	LC-MS 등급
포름산	Knowles	CAS 64-18-6	HPLC 등급
선형 이온 트랩 질량 분석기	Thermo Scientific	LTQ XL
액체 크로마토 그래프	Thermo Scientific	U3000
LTQ Tune	Thermo Scientific	버전 2.8.0	MS 제어 소프트웨어
메탄올	Thermo Scientific	CAS 67-56-1	LC-MS 등급
순수한 물	Thermo Scientific	CAS 7732-18-5	LC-MS 등급
Xcalibur	Thermo Scientific	버전 : 2.0	LC-IT-MS 운영 소프트웨어