Method Article

수동 수분, 현미경 및 S-유전자형 분석을 사용한 감귤류의 자체 (in)호환성 및 inter-(in)compatibility 관계 결정

DOI:

10.3791/65056

⸱

June 30th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Key Laboratory for Germplasm Innovation & Utilization of Horticultural Crops, Huazhong Agricultural University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 감귤류 품종의 꽃가루 호환성과 비호환성을 결정하는 빠른 방법을 제공합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Citrus는 자가 꽃가루를 거부하기 위해 S-RNase 기반 자가 비호환성을 사용하므로 성공적인 수분 및 수정을 위해 근처의 수분 매개체 나무가 필요합니다. 그러나 수분 조절제 역할을 할 적절한 품종을 식별하는 것은 시간이 많이 걸리는 과정입니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 아가로스 겔 전기 영동 및 아닐린 블루 염색을 활용하는 수분 호환 감귤 품종을 식별하는 신속한 방법을 개발했습니다. 꽃가루 적합성은 전체 DNA를 추출하고 특정 프라이머로 PCR 기반 유전형 분석을 수행하여 S 유전자형을 식별하여 결정됩니다. 또한, 수동 수분 후 3-4 일 후에 스타일을 수집하고 아닐린 블루 염색을 수행합니다. 마지막으로 꽃가루관의 성장 상태를 형광현미경으로 관찰합니다. 꽃가루 적합성과 비호환성은 꽃가루 튜브 성장이 각각 정상인지 억제되는지 관찰하여 확인할 수 있습니다. 단순성과 비용 효율성으로 인해이 방법은 서로 다른 감귤류 품종의 꽃가루 호환성과 비 호환성을 결정하여 서로 다른 품종 간의 비 호환성 그룹 및 비 호환성 관계를 설정하는 효과적인 도구입니다. 이 방법은 적합한 수분 매개체 나무를 성공적으로 선택하는 데 필수적인 정보를 제공하므로 새로운 과수원을 설립하고 육종 프로그램에 적합한 부모를 쉽게 선택할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

자기 비호환성(SI)은 속씨식물 종의 약 40%에 존재하는 유전적으로 제어되는 메커니즘입니다. 이 과정에서 암술은 동일한 SI 유전자형을 가진 식물의 꽃가루를 거부하여 자가 수정을 방지합니다 1,2. Ma jia pummelo는 중국 Jinagsu 지방의 지역 품종으로 크고 분홍색 과일, 풍부한 주스 함량, 새콤 달콤한 맛 및 두꺼운 껍질의 우수한 품질을 가지고 있습니다3. SI는 이종 교배를 촉진하지만, 과일의 수확량과 품질에 부정적인 영향을 미치며4 신뢰할 수 있는 과일 경화율과 높은 수확량을 위해 뚜렷한 SI 유전자형을 가진 적절한 수분 매개체 나무를 필요로 한다. 현재 SI에는 Brassicaceae로 대표되는 포자자기비적합성(SSI)과 장미과, 양귀비과, Rutaceae 및 Solanaceae로 대표되는 배우자생자부적합성(GSI)의 두 가지 주요 유형이 있습니다 5,6,7,8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 아닐린 블루 염색 준비

  1. 실험을 위해 수분 매개자 브러시, 핀셋, 연필, 황산염 종이, 수분 백, 지퍼 잠금 백, 종이 클립, 포름 알데히드, 빙초산, 절대 에탄올, 원심 분리기 튜브, 집게, 접착제 점 적기, 유리 슬라이드, 커버 슬립, 메스 및 폴리에틸렌 글리콜.
  2. 0.02%MgSO4, 0.01% KNO3, 0.03% Ca(NO3)2, 0.01%H3BO3, 20% PEG-4000 및 15% 자당을 포함하는 시험관 내 발아 배지를 준비합니다. KOH로 pH를 6.0-6.2로 조정합니다. PEG-4,000은 용해하기 어렵기 때문에 마그네틱 교반기를 사용하십시오.
  3. 무수 에탄올과 빙초산을 3:1의 비율로 혼합한 Carnoy의 고정액을 준비합니다. 40 % 포름 알데히드, 80 % 에탄올 및 빙초산 (1 : 8 : 1) 인 FAA 고정 용액을 준비합니다. 4 M 수산화나트륨 (NaOH) 및 아닐린 청색 용액을 제조하고, 이는 0.1 M K3PO4 중 0.1 % 아닐린 청색이다. 아닐린 블루 용액은 빛에 민감하므로 호박색 병을 사용하여 보관하십....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서 수행된 실험을 위해 성숙한 꽃을 선택하고 꽃밥을 모아 오븐에서 건조시킨 다음 꽃가루를 28°C에서 12시간 동안 발아시켰습니다. 꽃가루 생존율과 발아율은 그림 1과 같이 정량화되었습니다.

감귤류는 수동으로 수분되었고, 꽃가루 적합성 및 비호환성은 아닐린 블루 염색 및 형광 현미경을 사용하여 평가되었습니다. 호환 가능한 꽃가루는 암술머리의 표면에서 발아하여 성장할 수 있는 정상적인 꽃가루 관을 생성하여 궁극적으로 난소에서 수정을 유도할 수 있습니다. 대조적으로, 호환되지 않는 꽃가루 튜브는 스타일의 약 2/3를 통해 성장한 다음 성장을 멈췄습니다(그림 2).

S 유전자형을 확인하기 위해, 식물로부터 전체 DNA를 추출하였다. 특정 프라이머는 PCR 반응에서 S 유전자좌의 일부를 증폭하.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

과일 작물에서 parthenocarpy와 SI는 모두 씨없는 과일의 길을 열어주기 때문에 중요한 특성입니다. 자기 비 호환성은자가 꽃가루의 거부를 촉진하여 근친 교배를 예방합니다20. 감귤류 중에서, pummelo는 자기 양립 할 수없는 품종입니다7. 모든 속씨식물 종의 거의 40%가 SI21을 나타냅니다. 이 특성은 과일 세팅을 방지하고 수확량을 낮추며 재배자에게 막대한 경제적 손실을 가져옵니다. 이 문제를 해결하기 위해 농부들은 과수원 전체에 수분 조절제 나무를 포함합니다. 그러나 적절한 수분 조절제 나무를 선택하는 것은 시간이 많이 걸리는 실험실 실험이 필요한 어려운 작업입니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 우리는 SI 유전자형을 식별하고 다양한 감귤류 품종의 꽃가루 호환성 및 비호환성을 결정하여 수분 매개자 나무의 정확한 선택을 용이하게 하는 신속한 방법을 개발했습니다. 또한, 꽃가루 생존율 및.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다고 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로젝트는 중국 국립 자연 과학 재단 (32122075, 32072523)의 재정 지원을 받았습니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
절대 에탄올Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd10009218
아닐린 블루Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd
붕산, H3BO<>sub3Sinopharm 화학 시약Co., Ltd10004818
갈색 병Labgic Technology Co., Ltd
질산 칼슘 tetrahydrate, Ca (NO3 ) 2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd80029062
원심 분리기Labgic Technology Co., Ltd
원심 분리기 튜브Labgic Technology Co., Ltd
CTABGEN-VIEW SCIENTIFIC INC57-09-0 (CAS)
DroppingJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
에틸렌 디아민 테트라 아세트산, EDTASinopharm 화학 시약 유한 공사10009617
겸LUXIANZI 생명 공학 유한 공사
포름 알데히드Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd10010018
완전 자동 샘플 고속 분쇄Shanghai Jingxin Industrial Development Co., LtdTissuelyser-96
빙하Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd10000218
연삭 튜브상하이 Jingxin 산업 개발 유한 공사
이소 아밀 알코올시노팜 화학 시약 유한 공사10003218
이소 프로필 알코올시노 팜 화학 시약 유한 공사80109218
라벨M & 공급자:G Chenguang Stationery Co., Ltd.
라이카 DMi8상하이 Leica Co., Ltd21903797
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트, MgSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10013018
현미경 커버 유리Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
NaClSinopharm 화학 시약 Co., Ltd10019318
종이 클립엠앤드 공급자:G Chenguang Stationery Co., Ltd.
연필M & 공급자:G Chenguang Stationery Co., Ltd.
수분 매개체 브러시Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd
폴리에틸렌 글리콜, PEG 6000Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., LtdDH229-1
폴리에틸렌 글리콜, PEG-4000Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd1521GR500
수산화칼륨, KOHSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10017008
질산칼륨, KNO3Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10017218
ScalpelJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
SlideZhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
수산화나트륨, NAOHSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019718
설탕Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd
황산염 종이Taizhou Jinnong Mesh 공장
온도 조절기 수조Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., LtdL-909193
트리클로로 메탄Sinopharm 화학 시약 유한 공사10006818
인산 트리칼륨 삼염기 삼수화물, K3PO4Shanghai Lingfeng 화학 시약 유한 공사20032318
Tris-HClGEN-VIEW SCIENTIFIC INC1185-53-1
지퍼 잠금 백M & 공급자:G Chenguang Stationery Co., Ltd.
β-메르캅토에탄올GEN-VIEW SCIENTIFIC INC60-24-2(CAS)
튜브 자 기 아세트산 10021418

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
  2. Goldberg, E. E., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Citrus Self IncompatibilityS Genotype AnalysisManual PollinationPollen CompatibilityAniline Blue StainingAgarose Gel ElectrophoresisFluorescence MicroscopyPollen Tube GrowthPCR GenotypingPollinizer Selection

Related Articles