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방법 논문

수동 수분, 현미경 및 S-유전자형 분석을 사용한 감귤류의 자체 (in)호환성 및 inter-(in)compatibility 관계 결정

3.2K 조회수

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DOI:

10.3791/65056

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2023년 6월 30일

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1National Key Laboratory for Germplasm Innovation & Utilization of Horticultural Crops, Huazhong Agricultural University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 감귤류 품종의 꽃가루 호환성과 비호환성을 결정하는 빠른 방법을 제공합니다.

초록

Citrus는 자가 꽃가루를 거부하기 위해 S-RNase 기반 자가 비호환성을 사용하므로 성공적인 수분 및 수정을 위해 근처의 수분 매개체 나무가 필요합니다. 그러나 수분 조절제 역할을 할 적절한 품종을 식별하는 것은 시간이 많이 걸리는 과정입니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 아가로스 겔 전기 영동 및 아닐린 블루 염색을 활용하는 수분 호환 감귤 품종을 식별하는 신속한 방법을 개발했습니다. 꽃가루 적합성은 전체 DNA를 추출하고 특정 프라이머로 PCR 기반 유전형 분석을 수행하여 S 유전자형을 식별하여 결정됩니다. 또한, 수동 수분 후 3-4 일 후에 스타일을 수집하고 아닐린 블루 염색을 수행합니다. 마지막으로 꽃가루관의 성장 상태를 형광현미경으로 관찰합니다. 꽃가루 적합성과 비호환성은 꽃가루 튜브 성장이 각각 정상인지 억제되는지 관찰하여 확인할 수 있습니다. 단순성과 비용 효율성으로 인해이 방법은 서로 다른 감귤류 품종의 꽃가루 호환성과 비 호환성을 결정하여 서로 다른 품종 간의 비 호환성 그룹 및 비 호환성 관계를 설정하는 효과적인 도구입니다. 이 방법은 적합한 수분 매개체 나무를 성공적으로 선택하는 데 필수적인 정보를 제공하므로 새로운 과수원을 설립하고 육종 프로그램에 적합한 부모를 쉽게 선택할 수 있습니다.

서론

자기 비호환성(SI)은 속씨식물 종의 약 40%에 존재하는 유전적으로 제어되는 메커니즘입니다. 이 과정에서 암술은 동일한 SI 유전자형을 가진 식물의 꽃가루를 거부하여 자가 수정을 방지합니다 1,2. Ma jia pummelo는 중국 Jinagsu 지방의 지역 품종으로 크고 분홍색 과일, 풍부한 주스 함량, 새콤 달콤한 맛 및 두꺼운 껍질의 우수한 품질을 가지고 있습니다3. SI는 이종 교배를 촉진하지만, 과일의 수확량과 품질에 부정적인 영향을 미치며4 신뢰할 수 있는 과일 경화율과 높은 수확량을 위해 뚜렷한 SI 유전자형을 가진 적절한 수분 매개체 나무를 필요로 한다. 현재 SI에는 Brassicaceae로 대표되는 포자자기비적합성(SSI)과 장미과, 양귀비과, Rutaceae 및 Solanaceae로 대표되는 배우자생자부적합성(GSI)의 두 가지 주요 유형이 있습니다 5,6,7,8.

감귤류는 세계에서 가장 중요한 과일 작물 중 하나입니다. S-RNase 기반 GSI 시스템은 많은 감귤류 섭취에서 발견되며, 과실형성률에 부정적인 영향을 미친다9. 이 시스템에서, SI는 암술 S 결정인자와 꽃가루 S 결정인자를 운반하는 두 개의 복잡한 대립유전자를 갖는 단일 다형성 유전자 좌인 S 유전자좌에 의해 제어된다7. 여성 결정인자는 S 리보 뉴클레아제(S-RNase)이고 남성 결정인자는 S 유전자좌 F-box(SLF)7입니다. 암술의 세포는 S-RNase 단백질을 분비합니다. 비-자기 S-RNase는 SLF 단백질에 의해 인식되고, 이는 26S 프로테아좀 경로에 의한 비-자기 S-RNase의 유비퀴틴화 및 분해를 유도한다. 대조적으로, 자가 S-RNase는 SLF 단백질을 회피하기 때문에 꽃가루관(PT) 성장을 축적하고 억제할 수 있으며, 따라서 유비퀴틴화10,11,12,13을 방지할 수 있습니다.

여기에서 우리는 S-유전자형과 꽃가루 적합성 및 비적합성 정도를 식별하는 데 유용한 생체 내 기술을 보고합니다. 이 프로토콜은 잎에서 총 DNA를 추출하고 S 특이적 프라이머를 사용하여 S 유전자형을 예측하는 것을 포함합니다. 또한, 아닐린 블루 염색 및 형광 현미경 검사 후 손 수분은 호환성과 비호환성의 정도에 대한 증거를 제공합니다. 실험실14,15에서 꽃의 수동 수분을 포함하는 반 생체 내 수분 절차는 또한 자기 적합성 및 비 호환성의 정도를 평가하기 위해 조정되었습니다. 그러나 우리는 또한 꽃가루 튜브가 자연 조건에서 자랄 수 있도록 원치 않는 꽃가루로 인한 오염을 피하기 위해 꽃을 자루에 넣은 다음 밭 수분을 사용했습니다. 이 프로토콜은 간단하고 간단하며 적합한 수분 조절자 나무를 성공적으로 선택하는 데 필요한 정보를 제공합니다.

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프로토콜

1. 아닐린 블루 염색 준비

  1. 실험을 위해 수분 매개자 브러시, 핀셋, 연필, 황산염 종이, 수분 백, 지퍼 잠금 백, 종이 클립, 포름 알데히드, 빙초산, 절대 에탄올, 원심 분리기 튜브, 집게, 접착제 점 적기, 유리 슬라이드, 커버 슬립, 메스 및 폴리에틸렌 글리콜.
  2. 0.02%MgSO4, 0.01% KNO3, 0.03% Ca(NO3)2, 0.01%H3BO3, 20% PEG-4000 및 15% 자당을 포함하는 시험관 내 발아 배지를 준비합니다. KOH로 pH를 6.0-6.2로 조정합니다. PEG-4,000은 용해하기 어렵기 때문에 마그네틱 교반기를 사용하십시오.
  3. 무수 에탄올과 빙초산을 3:1의 비율로 혼합한 Carnoy의 고정액을 준비합니다. 40 % 포름 알데히드, 80 % 에탄올 및 빙초산 (1 : 8 : 1) 인 FAA 고정 용액을 준비합니다. 4 M 수산화나트륨 (NaOH) 및 아닐린 청색 용액을 제조하고, 이는 0.1 M K3PO4 중 0.1 % 아닐린 청색이다. 아닐린 블루 용액은 빛에 민감하므로 호박색 병을 사용하여 보관하십시오.

2. 꽃가루 수집

  1. 실험 나무 (이 연구에서는 Ma jia pummelo)의 개화시기를 미리 알아 두십시오. 개화기 초기부터 개화시기까지 성숙한 미개화 꽃을 모아 지퍼백에 넣어주세요. 꽃은 4 °C에서 냉장고에 24시간 동안 보관할 수 있습니다.
  2. 꽃을 실험실로 가져 가십시오. 핀셋을 사용하여 꽃밥을 모으고 여과지가 들어있는 페트리 접시에 넣으십시오. 꽃밥을 20-30 개로 모으십시오.
  3. 꽃밥이 들어 있는 페트리 접시를 꽃가루 알갱이가 마를 때까지 28°C 오븐에 24시간 동안 넣습니다. 자세한 꽃 조직에 대해서는 Hu et al.9를 참조하십시오.
  4. 건조된 꽃가루를 1.5mL 원심분리기 튜브에 넣습니다. 꽃가루는 색이 변하는 실리카겔(건조제)이 들어 있는 밀폐된 지퍼백에 보관합니다. 가방을 닫고 꽃가루 품종의 이름과 보관 날짜를 가방에 표시하십시오. 건조된 꽃가루는 -20°C의 냉장고에서 96주 동안 보관할 수 있다16.

3. 체외 꽃가루 발아 시험

  1. 300 μL의 액체 배지를 세포 배양 접시 또는 2 mL 원심 분리 튜브의 캡에 붓고 수분 브러시를 사용하여 꽃가루를 골고루 뿌립니다. 꽃가루를 28°C의 가습된 어두운 환경에서 12시간 동안 배양합니다.
  2. 1,000 μL 피펫 팁의 상단 1 mm를 제거합니다. 피펫을 사용하여 소량의 배양액으로 꽃가루를 흡수하고 현미경 슬라이드 중앙으로 이동합니다. 커버슬립으로 덮으십시오. 10x 대물렌즈를 사용하여 도립 현미경으로 표본을 관찰합니다.
  3. 각 복제물에 대해 거의 동일한 꽃가루 밀도를 사용하여 3개의 독립적인 복제를 수행합니다17. 꽃가루의 양을 시각적으로 관리하여 페트리 접시 전체가 꽃가루로 덮여 있고 각 페트리 접시에 거의 같은 양의 꽃가루가 있는지 확인하십시오.
  4. 발아 된 꽃가루는 직경의 약 두 배 길이의 꽃가루 관을 생성합니다. 20개의 시야에서 발아율을 계산하여 모든 꽃가루 밭에서 발아된 꽃가루의 비율을 제공합니다.

4. 수분

  1. 수분을 위해 바람이없는 맑은 날을 선택하십시오. 완전히 발달 된 새싹 10 개를 선택하여 꽃잎을 조심스럽게 벗기고 멍이 들지 않도록주의하십시오.
  2. 수분 브러시를 사용하여 충분한 양의 생존 가능한 꽃가루를 암술머리 표면에 뿌리고 암술이 손상되지 않도록 주의하십시오. 자가 수분을 위해서는 동일한 식물/품종의 꽃가루를 사용하십시오. 교차 수분을 위해서는 유전자형이 다른 식물의 꽃가루를 사용하십시오.
  3. 수분 된 꽃을 황산염 종이 봉지로 덮으십시오. 종이 클립을 사용하여 가방을 밀봉하고 유전형적으로 구별되는 꽃가루에 의한 수분을 방지하십시오.
  4. 라벨에 종의 이름과 수분의 수와 시간을 쓰십시오. 수분 된 꽃 근처의 가지에 라벨을 걸어 놓습니다.

5. 샘플링, 고정 및 보존

  1. 수분 후 약 3-4 일 후에 수분 주머니를 제거하고 수분 된 꽃을 지퍼 잠금 가방에 모으십시오.
  2. 즉시 꽃에서 꽃잎, 용기 및 난소를 제거하고 스타일에 융합 된 암술머리를 새로 준비된 고정 용액이 들어있는 원심 분리기 튜브에 담그십시오. 4°C에서 밤새 고정액에 암술머리와 스타일을 배양합니다.
  3. 다음날, 정착액을 버리고, 95 % 에탄올로 2-3 회 암술머리와 스타일을 씻으십시오.
  4. 스타일을 70 % 에탄올 용액으로 옮깁니다. 샘플이 용액에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. 이 단계의 스타일은 4 °C에서 1-2개월 동안 보관할 수 있습니다.

6. 아닐린 블루 염색

  1. 70% 에탄올에 보관된 스타일 샘플을 증류수로 3-4회 세척한다. 4M NaOH 용액에 담그고 밀봉한 후 65°C 수조에서 60분 동안 배양합니다. 이 단계에서 스타일의 색상이 노란색-흰색에서 주황색-빨간색으로 바뀝니다.
  2. 스타일을 증류수에 30분 동안 담가둡니다. 증류수를 버리고 증류수로 스타일을 3-4 번 또는 스타일의 색상이 노란색이 될 때까지 씻으십시오.
  3. 샘플을 10mL 튜브에 넣고 샘플이 담글 때까지 아닐린 블루를 첨가하고 어두운 곳에서 12시간 동안 염색합니다.
  4. 형광 현미경으로 꽃가루 관의 성장을 관찰합니다.

7. 형광 현미경

  1. 표본을 관찰하기 전에 슬라이드를 평평한 테이블에 놓고 슬라이드 표면에 폴리에틸렌 글리콜 2-3 방울을 추가합니다.
  2. 관찰 할 스타일을 증류수로 씻으십시오. 메스를 사용하여 세로축을 따라 두 개의 반쪽으로 나눕니다. 스타일의 절반을 유리 슬라이드에 놓고 커버 슬립으로 덮습니다.
  3. 조리개 위의 현미경 스테이지에 슬라이드를 놓고 10x 대물렌즈를 사용하여 시각화합니다. DAPI 필터(여기: 325-375nm, 방출: 435-485nm)를 사용합니다. 각 수분 유형에 대해 5 가지 스타일을 관찰하십시오. 꽃가루 튜브 성장을 관찰하십시오.

8. PCR 기반 S 유전자형 동정

  1. CTAB 방법18을 사용하여 낙인 샘플에서 게놈 DNA를 추출합니다.
    1. 수집 된 잎을 2mL 원심 분리기 튜브에 넣고 액체 질소에서 급속 동결합니다. HCl:EDTA:NaCl:H 2O 완충액을 1:1:3:5의 비율로 준비하고 클로로포름 이소아밀 알코올 혼합물을24:1의 비율로 준비합니다
    2. 제조된 완충액 10 mL, CTAB 0.2 g, 메르캅토에탄올 200 μL를 50 mL 원심분리기 튜브에 넣고, 용액이 투명하고 투명해질 때까지 65°C의 수조에 5분 동안 담가한다.
    3. 칼날을 박격포에 넣고 냉동 샘플을 넣고 액체 질소를 넣고 갈아줍니다. 분쇄 샘플을 2mL 원심분리기 튜브에 넣고 CTAB 혼합물 600μL를 넣고 65°C의 수조에 60분 동안 넣고 30분마다 거꾸로 혼합합니다.
    4. 클로로포름 이소아밀 알코올 혼합물(24:1) 700μL를 넣고 10분 동안 거꾸로 혼합합니다. 12,000 x g 에서 24°C에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 피펫팅하고, 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
    5. 5M NaCl 용액 60μL와 무수 에탄올 1mL를 넣고 거꾸로 섞는다. -20°C에서 30분 동안 동결하고 24°C 및 9,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    6. 상청액을 버리고 70 % 에탄올 용액 1mL를 넣고 실온에서 1-2 시간 동안 방치한다. 24 °C, 9,000 x g 에서 5 분 동안 원심 분리하고, 상청액을 버리고, 과량의 에탄올 용액을 흡인하고, 5 분 동안 자연 건조시킨다.
    7. 멸균수 100μL를 넣어 용해시키고 분광광도계로 DNA 농도를 측정한 후 -4°C 냉동고에서 냉동하여 장기간 보관합니다.
    8. RT-PCR 반응 시스템을 구성합니다. 5μL의 2x PCRMix, 각각 0.25μL의 정방향 및 역방향 프라이머, 1μL의 DNA(100ng/μL) 및 3.5μL의H2O를 포함하는 10μL에 대한 다음 반응 혼합물을 준비합니다.
  2. 표 1에 따라 PCR 프로그램을 설정합니다. 모든 이소형에 대한 PCR 프로그램은 5분 동안 95°C 32x (30초 동안 95°C, 30초 동안 55°C, 및 1분 동안 72°C) 및 5분 동안 72°C였습니다. 생성물을 1.5% TAE-agarose gels에서 분리하고 사진9를 촬영한다. 게놈 DNA를 사용하여 지정된 S 유전자형을 확인합니다.

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결과

여기에서 수행된 실험을 위해 성숙한 꽃을 선택하고 꽃밥을 모아 오븐에서 건조시킨 다음 꽃가루를 28°C에서 12시간 동안 발아시켰습니다. 꽃가루 생존율과 발아율은 그림 1과 같이 정량화되었습니다.

감귤류는 수동으로 수분되었고, 꽃가루 적합성 및 비호환성은 아닐린 블루 염색 및 형광 현미경을 사용하여 평가되었습니다. 호환 가능한 꽃가루는 암술머리의 표면에서 발아하여 성장할 수 있는 정상적인 꽃가루 관을 생성하여 궁극적으로 난소에서 수정을 유도할 수 있습니다. 대조적으로, 호환되지 않는 꽃가루 튜브는 스타일의 약 2/3를 통해 성장한 다음 성장을 멈췄습니다(그림 2).

S 유전자형을 확인하기 위해, 식물로부터 전체 DNA를 추출하였다. 특정 프라이머는 PCR 반응에서 S 유전자좌의 일부를 증폭하...

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토론

과일 작물에서 parthenocarpy와 SI는 모두 씨없는 과일의 길을 열어주기 때문에 중요한 특성입니다. 자기 비 호환성은자가 꽃가루의 거부를 촉진하여 근친 교배를 예방합니다20. 감귤류 중에서, pummelo는 자기 양립 할 수없는 품종입니다7. 모든 속씨식물 종의 거의 40%가 SI21을 나타냅니다. 이 특성은 과일 세팅을 방지하고 수확량을 낮추며 재배자에게 막대한 경제적 손실을 가져옵니다. 이 문제를 해결하기 위해 농부들은 과수원 전체에 수분 조절제 나무를 포함합니다. 그러나 적절한 수분 조절제 나무를 선택하는 것은 시간이 많이 걸리는 실험실 실험이 필요한 어려운 작업입니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 우리는 SI 유전자형을 식별하고 다양한 감귤류 품종의 꽃가루 호환성 및 비호환성을 결정하여 수분 매개자 나무의 정확한 선택을 용이하게 하는 신속한 방법을 개발했습니다. 또한, 꽃가루 생존율 및...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 프로젝트는 중국 국립 자연 과학 재단 (32122075, 32072523)의 재정 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
절대 에탄올Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd10009218
아닐린 블루Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd
붕산, H3BO<>sub3Sinopharm 화학 시약Co., Ltd10004818
갈색 병Labgic Technology Co., Ltd
질산 칼슘 tetrahydrate, Ca (NO3 ) 2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd80029062
원심 분리기Labgic Technology Co., Ltd
원심 분리기 튜브Labgic Technology Co., Ltd
CTABGEN-VIEW SCIENTIFIC INC57-09-0 (CAS)
DroppingJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
에틸렌 디아민 테트라 아세트산, EDTASinopharm 화학 시약 유한 공사10009617
겸LUXIANZI 생명 공학 유한 공사
포름 알데히드Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd10010018
완전 자동 샘플 고속 분쇄Shanghai Jingxin Industrial Development Co., LtdTissuelyser-96
빙하Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd10000218
연삭 튜브상하이 Jingxin 산업 개발 유한 공사
이소 아밀 알코올시노팜 화학 시약 유한 공사10003218
이소 프로필 알코올시노 팜 화학 시약 유한 공사80109218
라벨M & 공급자:G Chenguang Stationery Co., Ltd.
라이카 DMi8상하이 Leica Co., Ltd21903797
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트, MgSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10013018
현미경 커버 유리Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
NaClSinopharm 화학 시약 Co., Ltd10019318
종이 클립엠앤드 공급자:G Chenguang Stationery Co., Ltd.
연필M & 공급자:G Chenguang Stationery Co., Ltd.
수분 매개체 브러시Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd
폴리에틸렌 글리콜, PEG 6000Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., LtdDH229-1
폴리에틸렌 글리콜, PEG-4000Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd1521GR500
수산화칼륨, KOHSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10017008
질산칼륨, KNO3Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10017218
ScalpelJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
SlideZhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
수산화나트륨, NAOHSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019718
설탕Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd
황산염 종이Taizhou Jinnong Mesh 공장
온도 조절기 수조Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., LtdL-909193
트리클로로 메탄Sinopharm 화학 시약 유한 공사10006818
인산 트리칼륨 삼염기 삼수화물, K3PO4Shanghai Lingfeng 화학 시약 유한 공사20032318
Tris-HClGEN-VIEW SCIENTIFIC INC1185-53-1
지퍼 잠금 백M & 공급자:G Chenguang Stationery Co., Ltd.
β-메르캅토에탄올GEN-VIEW SCIENTIFIC INC60-24-2(CAS)
튜브 자 기 아세트산 10021418

참고문헌

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  23. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments. (160), e60241(2020).

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