BS3 화학적 가교 분석은 만성 심리사회적 스트레스 조건 하에서 마우스 뇌에서 감소된 세포 표면 GABAA 수용체 발현을 보여줍니다.
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방법 논문
BS3 화학 가교 분석: 설치류 뇌의 세포 표면 GABAA 수용체 표현에 대한 만성 스트레스의 영향 평가
이 논문에서
요약
초록
불안은 인지 기능을 포함하여 동물의 행동에 다양한 영향을 미치는 감정 상태입니다. 불안의 행동 징후는 동물계 전체에서 관찰되며 광범위한 스트레스 양식에 대한 적응 또는 부적응 반응으로 인식될 수 있습니다. 설치류는 분자, 세포 및 회로 수준에서 불안의 통합 메커니즘을 다루는 번역 연구를 위한 입증된 실험 모델을 제공합니다. 특히, 만성 심리사회적 스트레스 패러다임은 인간과 설치류 사이에 유사한 불안/우울과 유사한 행동 표현형을 모방하는 부적응 반응을 유도합니다. 이전 연구에서는 만성 스트레스가 뇌의 신경 전달 물질 함량에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났지만 신경 전달 물질 수용체 수준에 대한 스트레스의 영향은 충분히 연구되지 않았습니다. 이 기사에서는 특히 감정과 인지의 조절과 관련된 감마-아미노부티르산(GABA) 수용체에 초점을 맞춰 만성 스트레스를 받는 생쥐에서 신경 전달 물질 수용체의 신경 전달 물질 수용체의 신경 표면 수준을 정량화하는 실험 방법을 제시합니다. 막 불 투과성 비가역성 화학 가교제 인 bissulfosuccinimidyl suberate (BS3)를 사용하여 만성 스트레스가 전두엽 피질에서 GABAA 수용체의 표면 가용성을 상당히 하향 조절한다는 것을 보여줍니다. GABAA 수용체의 신경 표면 수준은 GABA 신경 전달에 대한 속도 제한 과정이므로 실험 동물 모델에서 불안 / 우울 유사 표현형의 정도에 대한 분자 마커 또는 프록시로 사용될 수 있습니다. 이 가교 접근법은 모든 뇌 영역에서 발현되는 신경 전달 물질 또는 신경 조절제에 대한 다양한 수용체 시스템에 적용할 수 있으며 감정과 인지의 기본 메커니즘에 대한 더 깊은 이해에 기여할 것으로 기대됩니다.
서론
신경전달물질 수용체는 뉴런 원형질막 표면 또는 세포내막(예: 엔도솜, 소포체[ER] 또는 트랜스-골지체)에 국한되어 있으며, 뉴런의 내재적 생리학적 상태 또는 외인성 신경망 활동에 대한 반응에 따라 이 두 구획 사이를 동적으로 왕복합니다 1,2. 새로 분비된 신경전달물질은 주로 표면에 국한된 수용체 풀을 통해 생리적 기능을 이끌어내기 때문에, 주어진 신경전달물질에 대한 표면 수용체 수준은 신경 회로 내에서 신호 전달 능력의 중요한 결정 요인 중 하나이다3.
배양된 뉴런의 표면 수용체 수준을 모니터링하기 위해 표면 비오티닐화 분석(surface biotinylation) 분석법4, 비투과화 조건에서 특정 항체를 사용한 면역형광분석법(immunofluorescence assay)5, pH 민감성 형광 광학 지시약(예: pHluorin)6과 유전적으로 융합된 수용체 이식유전자(receptor transgene)의 사용을 포함하여 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 대조적으....
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프로토콜
이 프로토콜의 모든 동물 작업은 온타리오 동물 연구법(RSO 1990, Chapter A.22) 및 캐나다 동물 관리 위원회(CCAC)에 따라 완료되었으며 기관 동물 관리 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물의 준비
- 실험에 사용할 동물 수를 결정하고 적절한 그룹 또는 실험 코호트로 나눕니다. 그룹 크기, 성별 및 통계적 검정력에 대한 토론은 토론 섹션을 참조하십시오.
참고: 이 프로토콜은 마우스(C57BL6/J 균주, 생후 2-4개월, 일반적으로 체중 20-30g, 동등한 수의 수컷과 암컷 사용)에 맞게 맞춤화되었습니다. - 동물을 UCMS 또는 대조군 비스트레스 조건 하에 5-8주 동안 두고, 앞서 기술한 바와 같은 프로토콜에 따라14.
- 마지막 UCMS 절차 후, 수용체 발현에 대한 급성 스트레스 효과를 피하기 위해 가교 분석에 사용하기 전에 동물을 1일 동안 홈 케이지에 머물게 합니다.
2. 원액의 준비
- 분석 전에 지시된 대로 다음 용액을 준비하고 보관하십시오.
- 40mL의 탈이온수에 14.6....
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결과
마우스 PFC에서 표면 α5-GABA AR 수준을 평가하기 위한 BS3 가교 분석의 타당성을 입증하기 위해, 우리는 SDS-PAGE에서 BS3 가교 및 비가교 단백질 샘플 각각 10μg을 실행하고 항-α5-GABAAR항체(토끼 다클론)를 사용하여 웨스턴 블롯으로 단백질을 분석했습니다(그림 7). 비-가교 단백질 샘플은 ~55 kDa에서 α5-GABA AR의 총량을 제공하는 반면, BS3-가교 단백질 샘플은 α5-GABAAR에 공유 가교결합된 단백질 복합체를 나타내는 고분자량 단백질 종과 함께 일정량의 내막 관련 α5-GABAAR(~55 kDa에서 이동)을 생성하였다. 표면 α5-GABAAR수준의 정량화를 위해, 우리는 가교 결합시 총 풀에서 ~ 55 kDa에서 α5-GABAAR의 고갈 정도를 평가할 수 있습니다. 실제적으로, α5-GABA<.......
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토론
만성적인 심리사회적 스트레스가 행동(즉, 감정 및 인지 장애)과 분자 변화(즉, GABAergic 유전자의 발현 감소 및 GABAergic 신경전달의 수반되는 결핍)에 미치는 영향은 잘 문서화되어 있지만10, 이러한 결핍의 기저에 있는 메커니즘은 추가 조사가 필요하다. 특히, 만성 스트레스가 ER 기능에 과부하를 일으켜 신경세포 프로테옴에 상당한 영향을 미치고 따라서 ER 스트레스가 상승한다는 것을 보여주는 최근 연구를 감안할 때15, 만성 스트레스가 ER 막을 통한 GABAAR 트래피킹에 영향을 미치는지 여부와 GABAAR의 변화된 트래피킹 또는 표면 수준이 어떻게 정신병리와 인과적으로 연결될 수 있는지에 대한 질문이 남아 있습니다.
이 프로토콜에 표시된 BS3 가교 분석은 이러한 질문 중 일부에 답하기 위한 강력한 접근 방식으로 작용할 것입니다. 예를 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다.
감사의 글
저자는 연구 기간 동안 동물을 돌봐준 CAMH 동물 시설 직원에게 감사를 표합니다. 이 연구는 캐나다 보건 연구소 (CIHR 프로젝트 보조금 # 470458 TT), CAMH의 디스커버리 펀드 (TP), 정신 분열증 및 우울증 연구를위한 전국 연합 (NARSAD 상 # 25637 ES) 및 캠벨 가족 정신 건강 연구소 (ES). E.S.는 새로운 GABAergic 화합물을 클리닉에 도입하는 데 전념하는 바이오 제약 회사인 Damona Pharmaceuticals의 설립자입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 m (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-메르캅토에탄올 | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS 시료 완충액 (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| 뇌 매트릭스 | Ted Pella | 15003 | 마우스용, 30 g 성인, 코로나, 1 mm |
| 염화칼슘 (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| 곡선형 프로브 | Fine Science Tools | 10088-15 | 총 해부학 프로브; 각도 45 |
| 탈이온수 | milli-Q | EQ 7000 | 초순수 [비저항 18.2 MΩ &미드닷; cm @ 25 ° C; 총 유기 탄소(TOC) ≤ 5ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 항체 | Invitrogen | PA5-31163 | 다클론 토끼 IgG; 화학적 가교 시 잘못된 신호 검출 |
| GABA-A R 알파 5 C-말단 항체 | R& D Systems | PPS027 | 다클론 토끼 IgG; 마우스 및 랫 |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| 염화마그네슘(MgCl2· 6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, 대체(NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| 염화칼륨(KCl) | Sigma | P9541 | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Sigma | P8340 | |
| PVDF 멤브레인 | Bio-Rad | 1620177 | |
| 가위(대) | Fine Science Tools | 14007-14 | 수술용 가위 - 톱니 |
| 가위 (작은) | 정밀 과학 도구 | 14060-09 | 정밀 가위 - 날카로운 |
| 염화나트륨 (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| 탁상용 refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
참고문헌
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T.
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재인쇄 및 허가
