Caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정

진핵 생물의 유성 생식은 수정 과정을 통해 배아를 형성하기 위해 합쳐지는 기능적 배우자의 생산을 필요로합니다. 모계 및 부계 배우자, 난자(난자), 정자는 감수분열과 배우자 형성의 특수한 세포 분열 및 분화 과정을 통해 생성된다¹. 감수 분열은 단일 이배체 세포로 시작하여 원래 부모 세포의 염색체 수의 절반을 포함하는 딸 세포의 형성으로 끝납니다. 배수성의 감소에서 독립적인 구색 및 교차 재조합을 통한 유전 물질의 셔플링에 이르기까지 감수분열은 여러 가지 중요한 기능을 수행합니다¹. 감수 분열의 오류는 배우자 내에 염색체가 너무 많거나 너무 적은 이수성을 유발할 수 있습니다. 염색체 불균형은 유산과 다운 증후군 및 에드워즈 증후군과 같은 발달 장애의 주요 원인이기 때문에 이수성의 발생률은 인체 건강에 엄청난 영향을 미친^다2.

수정(Fertilization)은 모계와 부계 배우자가 융합하여 새로운 유기체를 생성하는 과정이다³. 배우자-배우자 인식은 배우자 표면의 단백질에 의해 촉진된다³. 배우자 적합성 오류는 정자와 난자 융합이 진행되지 않아 불임으로 이어집니다. 정자와 난모세포의 융합은 유사분열 분열을 통해 단세포 배아에서 완전한 기능을 하는 다세포 유기체로의 발달 여정을 시작할 수 있는 활성 배아의 적절한 형성으로 이어지는 많은 사건을 유발한다⁴. 배아 발생 전반에 걸쳐, 발달을 조절하는 분자적 사건은 유기체의 적절한 성장을 가능하게 하기 위해 엄격하게 조절되고 정확한 타이밍을 맞춰야 한다⁵. 초기 발달 동안 적절한 세포 분화는 유기체가 만능 배아에서 본격적인 유기체로 전환함에 따라 중요합니다. 이러한 사건의 복잡성으로 인해 혼란은 배아 치사를 초래하는 발달 결함으로 이어질 수 있습니다.

Caenorhabditis elegans는 감수 분열, 수정 및 배아 발달을 연구하는 훌륭한 모델 유기체입니다. 예쁜꼬마선충은 수컷과 자웅동체의 두 가지 성별을 가진 투명한 선충류입니다. 자가 수정이 가능한 예쁜꼬마선충 자웅동체가 우세한 성이다 ^6,7. 자웅동체 생식선은 정자에 저장되는 네 번째 유충(L4) 단계에서 먼저 정자를 생산합니다. L4에서 성인기로의 전환에서 생식선은 난모세포 생산으로 전환되며, 난모세포는 저장된 정자를 통해 수정됩니다. 자웅동체에서 0.2% 미만의 비율로 발생하는 수컷은 정자만 생산하고 자웅동체와 짝짓기를 할 수 있습니다. 교차 수정(cross-fertilization)을 할 때, 남성 정자는 난모세포의 수정(pseudocyte)에서 자웅동체 정자를 능가한다⁸. 이것은 자가 수정 주식을 통해 동형접합 돌연변이를 비교적 쉽게 유지하고 유전자 교차를 통한 유전자 조작을 가능하게 합니다. 두 성별은 남성과 여성 생식선에서 감수 분열의 차이를 탐구하는 연구를 허용합니다. 또한, 예쁜꼬마선충과 그 알의 투명한 특성으로 인해 감수 분열, 배우자 형성, 수정 및 배아 발생 과정은 형광 이미징 기술을 사용하여 살아 있는 온전한 동물에서 연구할 수 있습니다.

예쁜꼬마선충의 감수분열, 수정 및/또는 배아 발달에 역할을 할 수 있는 유전자의 새로운 돌연변이를 분석할 때, 이러한 과정의 오류는 종종 생존 가능한 자손의 생산 실패 또는 감소로 이어지기 때문에 중요한 첫 번째 단계는 배아 생존력과 무리 크기를 결정하는 것입니다. 이 논문은 자가 수정 자웅동체 또는 자웅동체와 수컷 사이의 교배에서 생식력, 배아 생존력 및 무리 크기를 평가하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 고전적인 분석은 많은 예쁜꼬마선충 연구에서 사용되어 왔지만, 당사는 설정 및 정확한 정량화를 위한 표준화된 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 짝짓기 및 자손 생산을 허용하기 위해 개별 벌레 또는 수컷/자웅동체 쌍을 분리합니다. 자손 생산 및 생존력은 생존 가능한 자손 및 생존 불가능한 배아의 수를 결정하기 위해 일련의 날에 걸쳐 관찰됩니다. 실험이 끝나면 개별 무리를 분석하여 배아 생존율과 총 무리 크기를 계산합니다.

참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 실험용 플레이트 준비

1. MYOB(Modified Youngren's, Only Bacto-peptone) 배지로 직경 35mm의 페트리 접시를 준비합니다. MYOB 플레이트를 만들기 위해 Bacto 한천 20g, NaCl 2g, Trizma-HCl 0.55g, Trizma-OH 0.24g, Bacto 펩톤 3.1g, 콜레스테롤 1.6mL를 ddH2O 1L에 넣고₁₂₁°C에서 40분 동안 오토클레이브합니다. 55°C로 식히고 멸균 기술을 사용하여 용융된 매체 4mL를 각 35mm 페트리 접시에 붓습니다.
   알림: MYOB 1리터는 ~250개의 플레이트를 만들며 4°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 각 균주에 대해 3개의 반복 세트가 있는 복제당 최소 10명의 개체를 권장합니다.
2. 멸균 기술을 사용하여 플레이트 중간에 OP50 박테리아의 작은 반점(약 50μL)으로 플레이트를 시딩합니다.
   참고: 작은 잔디밭은 작은 지점이 수컷과 자웅동체 사이의 만남을 증가시켜 짝짓기 기회를 증가시키기 때문에 교차 수정을 평가하는 데 특히 중요합니다.

2. 배아 생존력 분석(자웅동체 자가수정)

1. 1일차
   1. 각 접시의 뒷면에 라벨을 붙입니다. 실험 내내 각 플레이트와 각각의 웜을 추적해야 합니다.
      참고: 선호하는 라벨링 기술-1일차: 웜 1, 1일차: 웜 2, ... 등.
   2. 개별 L4 단계 자웅동체를 각 플레이트에 옮깁니다. 배아나 다른 벌레가 접시에 옮겨지지 않도록 하십시오. 벌레가 성충으로 발달하고 20°C의 표준 배양 온도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 3일차에 이 플레이트에 점수를 매기십시오.
      참고: 온도에 민감한 돌연변이의 경우 실험 온도가 변경될 수 있습니다. 온도에 민감한 돌연변이의 경우, 배아 생존력 분석은 허용 온도(15-16 °C) 및 비허용 온도(24-26 °C) 모두에서 수행되어야 합니다.
2. 2일차
   1. 새 플레이트 세트에 라벨을 붙입니다-2일차: 웜 1, 2일차: 웜 2, ... 등.
   2. 1일차 개별 웜을 새 플레이트로 옮깁니다.
      참고: 이 벌레는 성체에 도달해야 하며 야생형 벌레는 이미 배아를 낳기 시작했어야 합니다.
   3. 벌레가 20°C 또는 기타 적절한 온도에서 24시간 동안 배아를 낳도록 합니다. 4일째에 이 판에 점수를 매기십시오.
3. 3일차
   1. 새 접시 세트에 라벨을 붙인다. 3일차: 웜 1, 3일차: 웜 2, ... 등.
   2. 2일차 개별 웜을 새 플레이트로 옮깁니다. 20°C 또는 기타 적절한 온도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 5일째에 이 번호판에 점수를 매기십시오.
      알림: 온도가 낮을 경우 부화 시간이 늘어납니다. 그에 따라 조정하십시오.
   3. 미세 마커를 사용하여 35mm 뚜껑에 격자 패턴을 그립니다. 이전에 계수된 웜을 추적하기 위해 계수를 위해 테스트 플레이트 아래에 격자 뚜껑을 놓습니다(그림 1A-B).
      1. 감별 세포 계수기를 사용하여 자손의 존재 또는 부재에 대해 1일째 플레이트에 점수를 매깁니다. 살아있는 애벌레와 부화하지 않은 배아를 세십시오.
         참고: 이 시점에서 생존 가능한 배아가 부화해야 할 만큼 충분한 시간이 경과했습니다. 부화하지 않은 배아는 죽은 것으로 추정됩니다.
      2. 개별 정사각형 내에서 정사각형 안에 있는 부화하지 않은 배아와 살아있는 유충을 세십시오(그림 1C-F).
      3. 정사각형 테두리에 있는 웜의 경우 웜 헤드의 위치를 기준으로 계산합니다. 머리가 사각형의 위쪽과 왼쪽 가장자리에 닿는 웜을 세십시오(아래쪽 또는 오른쪽 가장자리에 닿는 웜은 계산하지 마십시오. 그림 1D). 이 분석을 위해 수정되지 않은 난모세포를 계산하지 마십시오(그림 1F).
   4. 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오.
4. 4일차
   1. 2.3.3.1 단계에 설명된 대로 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 세어 2일차 플레이트를 채점합니다. 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오.
5. 5일차
   1. 2.3.3.1 단계에 설명된 대로 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 세어 3일째 플레이트를 채점합니다. 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오. 데이터 분석에 설명된 방법을 사용하여 얻은 데이터를 분석합니다.
      참고: 일부 유전적 돌연변이는 생식 주기가 지연되거나 확장될 수 있습니다. 3일차 플레이트 이후에도 배아가 계속 산란되는지 개별 균주를 모니터링합니다. 배아 생산이 4 일까지 중단되지 않으면 성인을 새로운 판으로 계속 옮깁니다.

3. 배아 생존력 분석(수컷/자웅동체 교차 수정)

1. 1일차
   1. 각 접시의 뒷면에 라벨을 붙입니다. 실험 내내 각 플레이트와 각각의 웜을 추적해야 합니다.
   2. 개별 L4 자웅동체 벌레를 각 플레이트에 옮깁니다. 배아나 다른 벌레가 접시에 옮겨지지 않도록 하십시오.
      참고: 정자를 생산하지 않는 fog-2 기능 상실 돌연변이와 같은 여성화 균주를 자웅동체 대신 사용할 수 있습니다.
   3. 단일 L4 수컷 벌레를 L4 자웅동체가 들어 있는 각 라벨이 붙은 판에 옮깁니다. 배아나 다른 벌레가 접시에 옮겨지지 않도록 하십시오.
      참고: plg-1 변종 수컷과 같은 균주는 짝짓기 후 자웅동체 외음부에 교합 플러그를 부착하기 때문에 짝짓기가 발생했는지 여부를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
   4. 벌레가 20°C 또는 다른 적절한 온도에서 24시간 동안 짝짓기를 하고 자손을 낳도록 합니다. 3일째에 살아있는 유충 대 부화하지 않은 배아에 대해 이 플레이트에 점수를 매깁니다.
2. 2일차
   1. 새 플레이트 세트에 라벨을 붙이고 위의 2일차와 같이 웜을 옮깁니다. 이 경우 자웅동체와 수컷을 모두 새 판에 옮겨야 합니다. 자웅동체가 성인기에 도달했는지 확인하십시오.
   2. 자웅동체가 20°C 또는 다른 적절한 온도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 4일째에 살아있는 유충 대 부화하지 않은 배아에 대해 이 플레이트에 점수를 매깁니다.
3. 3일차
   1. 새 플레이트 세트에 라벨을 붙이고 위의 3일차와 같이 웜을 옮깁니다. 자웅동체와 수컷을 모두 새 접시에 옮겨야 합니다.
   2. 20°C 또는 다른 적절한 온도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 5일째에 살아있는 배아와 부화하지 않은 배아에 대해 이 플레이트에 점수를 매기십시오.
   3. 감별 세포 계수기를 사용하여 단계 2.3.3.1에 설명된 대로 1일째 플레이트에서 살아있는 유충과 부화되지 않은 배아를 계산합니다.
      알림: 접시는 4일차에 필요하므로 버리지 마십시오.
   4. 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오.
4. 4일차
   1. 2.3.3.1 단계에서 설명한대로 2 일째 판에서 살아있는 자손과 부화하지 않은 배아를 계산합니다. 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오.
   2. 남성용 1일차 플레이트를 확인하세요. 짝짓기가 발생하면 수컷에 대한 자웅동체의 예상 유전 비율은 50:50이어야 합니다. 1일차 플레이트에 수컷이 포함되어 있지 않으면 수컷과 자웅동체 사이의 짝짓기가 발생하지 않았습니다. 이 짝짓기 쌍을 버리고 이 관찰을 실험실 노트에 기록하십시오.
5. 5일차
   1. 2.3.3.1 단계에서 설명한대로 3 일째 판에서 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 계산합니다. 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오. 데이터 분석에 설명된 방법을 사용하여 얻은 데이터를 분석합니다.

4. 데이터 분석

1. 식 (1)을 사용하여 균주의 주어진 생물학적 복제물의 배아 생존율 백분율을 계산합니다.
   참고: 살아있는 자손과 부화하지 않은 배아의 수는 실험 기간 동안의 일일 수를 합산하여 얻습니다.
   (1개)
2. 부모 자웅동체에 의해 생산된 자손(부화하지 않은 배아 및 유충)의 수를 합산하여 주어진 균주의 벌레당 무리 크기를 계산합니다. 방정식 (2)를 사용하여 평균 새끼 크기를 계산합니다.
   (2개)
3. 배아 생존율과 평균 무리 크기를 생물학적 복제 간의 평균 및 표준 편차와 함께 보고합니다. 대조군 데이터와 실험 데이터를 비교하는 스튜던트 t-검정을 수행합니다.

우리는 N2(야생형)와 감수분열에 관여하는 유전자에 돌연변이가 있는 두 가지 균주인 him-5(e1490) 및 spo-11(ok79)에 대해 배아 생존력 및 무리 크기 분석을 수행했습니다. him-5와 spo-11 모두 감수 분열 교차 형성에 역할을 하기 때문에 이 두 유전자의 돌연변이는 이수성 배우자의 형성을 초래합니다. N2에 대한 이 배아 생존력 분석은 98.9%의 생존율을 보인 반면, him-5(e1490) 및 spo-11(ok79)은 각각 74.9% 및 0.8%의 백분율로 자손 생존율의 감소를 보여주었습니다(그림 2A; p < 0.0005). 이러한 결과는 이전에 발표된 결과 7,9와 일치합니다. N2, him-5(e1490) 및 spo-11(ok79)의 평균 무리 크기는 각각 217, 105 및 219로 결정되었습니다(그림 2B). 이전 간행물과 일관되게, him-5(e1490)는 야생형에 비해 무리 크기가 현저히 감소한 반면, spo-11(ok79)은 7,9가 아닙니다.

그림 1: 플레이트의 계수 설정 및 배아 형태 시연 . (A) 미세한 샤피를 사용하여 그린 십자형 격자 패턴이 있는 뚜껑 이미지. (B) 계산을 위해 아래에 패턴이 있는 뚜껑이 있는 35mm MYOB 플레이트. (C) 그리드의 여러 상자를 보여주는 저배율(10x) 시야를 보여주는 이미지. 흰색 화살촉은 이 시야 내에서 여러 유충을 가리킵니다. 계수는 유충과 배아를 모두 관찰하기 위해 더 높은 배율(들판에서 단 한 칸)에서 이루어져야 합니다. 스케일 바 = 1,000 μm. (D) 격자 패턴이 있는 뚜껑의 만화를 35mm 플레이트 아래에 놓습니다. 삽입물은 주어진 사각형에서 어떤 유충이 계산되는지 결정하는 적절한 기술을 나타냅니다. 위에서 아래로, 왼쪽에서 오른쪽으로 센다. 사각형 안에 있는 모든 웜을 세십시오. 경계에 닿는 웜은 꼬리가 아닌 웜 머리의 위치를 기준으로 계산해야 합니다. 현재 그리드를 향하는 웜 또는 이전에 계산된 그리드(예: 위쪽 및 왼쪽 가장자리)를 계산합니다. 머리가 아래쪽이나 오른쪽 가장자리에 닿는 웜을 세지 마십시오. 삽입부터 파란색 벌레는 계산되지만 빨간색 벌레는 계산되지 않습니다. (E) 건강한 N2 L1 부화한 유충(흰색 화살촉)의 대표 이미지. (F) 수정되지 않은 난모세포(검은색 화살촉)와 부화하지 않은 배아(빨간색 화살촉)의 대표 이미지. 수정되지 않은 난모세포는 이 분석에 포함되어서는 안 됩니다. 스케일 바 (E,F) = (100 μm). 참고: C, E, F 의 이미지는 Zeiss AxioZoom 현미경으로 촬영했으며, 웜 플레이트에 유충, 배아 및 난모세포의 모습을 보여주기 위해 카메라가 부착되었습니다. 배아 생존력 분석의 경우, 실체 현미경(카메라 없음)을 사용하여 플레이트를 관찰하면서 계수를 수행합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 배아 생존율 분석 및 새끼 크기의 결과를 나타내는 대표적인 그래프. (A) 20°C에서 N2, him-5(e1490) 및 spo-11(ok79)의 배아 생존율. (B) 20°C에서 N2, him-5(e1490) 및 spo-11(ok79)의 무리 크기 . 최소 28개의 자웅동체의 자손이 각 균주에 대해 점수를 매겼습니다. 부화하지 않은 배아와 유충의 총 수는 N2 = 6302, him-5(e1490) = 2,945, spo-11(ok79) = 7,230이었습니다. 오차 막대는 세 번의 개별 반복실험에 걸친 표준 편차를 나타냅니다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산된 통계량, n.s. = 유의하지 않음, *p < 0.0005. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.