이 기사는 여성 생식 조직에 대한 연구를 확장하기 위해 생쥐의 자궁경부, 직장 및 방광을 포함한 자궁천골 인대 및 기타 골반저 조직을 해부하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
골반 장기 탈출증(POP)은 골반저의 무결성, 구조 및 기계적 지지에 영향을 미치는 상태입니다. 골반저의 장기는 근육, 인대 및 골반 근막을 포함한 다양한 해부학적 구조에 의해 지지됩니다. 자궁천골 인대(uterosacral ligament, USL)는 하중을 지탱하는 중요한 구조이며, USL의 손상은 POP 발병 위험을 높입니다. 현재 프로토콜은 라만 분광법을 사용한 USL 생화학적 구성 및 기능에 대한 고유한 데이터 수집 및 기계적 거동 평가와 함께 쥐 USL 및 골반저 장기의 해부에 대해 설명합니다. 마우스는 전임상 연구를 위한 매우 중요한 모델이지만, 쥐 USL을 해부하는 것은 어렵고 복잡한 과정입니다. 이 절차는 USL을 포함한 쥐 골반저 조직의 해부를 안내하여 여러 평가 및 특성화를 가능하게 하는 접근 방식을 제시합니다. 이 작업은 기초 과학자와 엔지니어가 골반저 조직의 해부를 지원하여 USL 및 골반저 상태에 대한 연구와 마우스 모델을 사용한 여성 건강에 대한 전임상 연구의 접근성을 확대하는 것을 목표로 합니다.
서론
여성의 약 50%가 골반 장기 탈출증(POP)의 영향을 받습니다1,2. 이 여성의 약 11%는 성공률이 낮은 외과적 치료를 받기 위한 기준에 부합합니다(~30%)3,4. POP는 USL과 골반저 근육이 적절한 지지력을 제공하지 못하여 골반 장기(방광, 자궁, 자궁경부, 직장)의 일부 또는 전부가 자연적인 위치에서 하강하는 것을 특징으로 한다5. 이 상태는 해부학 적 기능 장애와 결합 조직의 파괴, 신경근 손상뿐만 아니라 predisposing 요인 3,6을 포함합니다. POP는 연령, 체중, 출산 및 분만 유형(예: 질 분만 또는 제왕절개)과 같은 여러 요인과 관련이 있습니다. 이러한 요인은 모든 골반저 조직의 기계적 무결성에 영향을 미치는 것으로 생각되며, 임신과 출산율이 POP 5,7,8
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프로토콜
모든 동물 실험 및 절차는 콜로라도 볼더 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜 #2705에 따라 수행되었습니다. 6주령의 암컷 C57BL/6J 마우스를 본 연구에 사용하였다. 동물들은 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료의 표 참조).
1. 동물 준비
- 제도적으로 승인된 방법에 따라 동물을 안락사시킵니다.
참고: 본 연구는 성공적인 안락사를 보장하기 위해 미국 수의학 협회(American Veterinary Medical Association)의 지침(분당 CO2로 챔버 부피의 30% 내지 70%의 변위율)에 따라 CO2 흡입을 사용한 후 자궁경부 탈구를 사용했습니다.- 가능하면 쥐 알레르겐의 확산을 최소화하기 위해 후드 아래에서 작업하십시오. 마우스가 움직이고 호흡을 멈추면 2분 이상 기다렸다가 반응이 없는지 확인합니다.
참고: 마우스가 임신 중이거나 산후인 경우 새끼를 개별적으로 안락사시켜야 합니다. E15.5 이상의 새끼는 해부 중에 참수해야 합니다.
- 가능하면 쥐 알레르겐의 확산을 최소화하기 위해 후드 아래에서 작업하십시오. 마우스가 움직이고 호흡을 멈추면 2분 이상 기다렸다가 반응이 없는지 확인합니다.
- 해부 패드, 11날 메스, 구부러진 얇은 날카로운 가위, 두 쌍의 집게, 구부러진 집게, 5-....
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결과
야생형 마우스의 해부의 각 단계는 프로토콜과 관련된 관련 비디오 및 그림에 자세히 설명되어 있습니다. 본 연구에서는 6주령의 암컷 C57BL/6J 마우스를 사용하였다(보충표 1). 서로 다른 효소로 처리된 USL을 사용한 3개의 샘플 그룹, 즉 대조군(무처리), 콜라게나제 처리 및 콘드로이티나제 처리 그룹을 분석했습니다. USL의 평활근, 신경 및 림프관은 섬유소 콜라겐과 글리코사미노글리칸(GAG)5이 풍부한 ECM으로 둘러싸여 있으며, 이는 조직에 기계적 무결성을 제공하는 것으로 생각됩니다. 효소 처리는 이러한 ECM 구성 요소를 파괴하고 라만 분광법 및 기계적(인장) 테스트를 사용하여 생화학적 및 기계적 차이를 해결할 수 있는 가능성을 입증하기 위해 선택되었습니다.
분해를 위해 모든 USL을 37°C 및 300rpm에서 1mL의 용액에 3시간 동안 열혼합기에 넣었습니다. 대조군 USL은 1x PBS 용액.......
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토론
구조적 손상이 여성 생식 조직에 미치는 영향은 충분히 연구되지 않았으며 POP 연구를 위해 쉽게 접근할 수 있는 동물 모델이 필요합니다. 마우스는 인간의 생식 연구를 모방할 수 있는 비용 효율적인 모델이다16. 여성 생식 기관 연구에 대한 관심이 높아짐에 따라 이러한 조직의 연구를 돕는 방법이 필요합니다. 이러한 요구를 해결하기 위해 이 작업에서는 구조 및 기능 분석을 위해 쥐 골반저 조직을 해부하고 준비하는 방법을 확립합니다.
해부의 성공을 위해서는 적절한 시간과 관리가 필요합니다. 쥐의 생식 조직은 작고 깨지기 쉽습니다. 특히 USL과 골반 장기를 둘러싼 지방을 제거할 때, 지방이 제거될 때 USL 또는 다른 조직이 손상되는 것을 방지하기 위해 세부 사항에 주의를 기울여야 합니다. 해부 현미경을 사용하여 USL과 지방의 차이를 식별하는 데 도움을 주는 것이 중요하며, 이는 훈련되지 않은 눈이 쉽게 혼동할 수 있습니다. 요관을 제거하면.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 CU Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) 보조금 (CB), NSF 대학원 연구 펠로우쉽 (LS), 슈미트 과학 펠로우쉽 (CL), 콜로라도 대학교 연구 및 혁신 종자 보조금 프로그램 (2020 년 V.F., S.C. 및 KC) 및 콜로라도 대학의 Anschutz Boulder Nexus Seed Grant (VF 및 KC). 로딩 챔버 설계에 도움을 주신 Tyler Tuttle 박사와 유용한 토론을 해주신 Calve 연구실 구성원에게 특별한 감사를 전합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 11 블레이드 | Fisher | 3120030 | 제거 가능한 블레이드 |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | 10x 농도 |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | |
| 콜라겐 분해 효소 유형 I | Worthington 생화학 | LS004194 | 효소 |
| 컨포칼 현미경 | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| 해부 현미경 | Leica | S9E | 카메라 포함 |
| Dumont #5 집게 | Fisher | NC9626652 | 얇은 팁 |
| 암 C57BL/6J 마우스 | Jackson 실험실 | 스트레인 #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN 로드셀 |
| FST 곡선 펜치 | Fisher | NC9639443 | 곡선 팁 |
| FST 샤프 9mm 가위 | Fisher | NC9639443 | 해부 가위 |
| 고스트 염료 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | 무료 아민 염색 |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | 50개의 물티슈 상자 |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | 조직 보존에 사용 |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | 제조업체의 지침을 따르십시오 |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | 해부된 조직에 사용 |
| Polyglactin 5-0 봉합 | Veter.Sut | VS385VL | 바늘 |
| Renishaw InVia 라만 현미경 | Renishaw | PN192(EN)-02-A | 컨포칼 목표 |
| 포함 록킹 플랫폼 | VWR | 10127-876 | 2단 플랫폼 |
| 수술용 장갑 | Fisher | 52818 | 해부용 |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | 핵 염색 |
| T-핀 | Fisher | S99385 | 해부용 |
| Pipets | Fisher | 13-711-7M | 전사 해부용 |
| 언더패드 | Fisher | 22037950 | 해부 패드를 덮기 위해 |
참고문헌
- Maldonado, P. A., Wai, C. Y. Pelvic organ prolapse. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 43 (1), 15-26 (2016).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice: Pregnancy-in....
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