이 프로토콜은 높은 시간 및 공간 분해능으로 막관통 전압 및 세포 내 Ca2+ 과도 현상의 전기 생리학적 측정을 포함하여 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥의 영향을 받는 야생형 및 녹인 동물에서 얻은 마우스 심장의 이중 염료 광학 매핑을 소개합니다.
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방법 논문
Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia의 RyR2R2474S Knock-In 마우스의 심장에 대한 이중 염료 광학 매핑
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
부정맥성 심장 질환인 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥(CPVT)은 신체 활동, 스트레스 또는 카테콜아민 챌린지 후 다형성 심실 빈맥 에피소드로 나타나며, 잠재적으로 치명적인 심실 세동으로 악화될 수 있습니다. 마우스 심장은 CPVT를 포함한 유전성 심장 부정맥 질환을 모델링하는 데 널리 사용되는 종입니다. Langendorff 관류된 쥐 심장의 막관통 전위(Vm)와 칼슘 과도성(CaT)의 동시 광학 매핑은 부정맥 발생의 기전을 밝힐 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 세포 수준 조사와 비교하여 광학 매핑 기술은 활성화, 전도 속도, 활동 전위 지속 시간 및 CaT 지속 시간 결정과 같은 일부 전기 생리학적 매개변수를 테스트할 수 있습니다. 이 논문은 이소프로테레놀 챌린지 전과 도중에 프로그래밍된 전기 페이싱과 결합된 쥐 야생형 및 이형접합 RyR2-R2474S/+ 심장에서 CaT 및 Vm의 고처리량 광학 매핑을 위한 기기 설정 및 실험 절차를 제시합니다. 이 접근법은 생체 외 마우스 심장 제제에서 CPVT 질환을 기계적으로 연구하기 위한 실현 가능하고 신뢰할 수 있는 방법을 입증했습니다.
서론
유전성 심장 질환 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥(CPVT)은 신체 활동, 스트레스 또는 카테콜아민 챌린지 후 다형성 심실 빈맥(PVT) 에피소드로 나타나며, 잠재적으로 치명적인 심실세동으로 악화될 수 있습니다 1,2,3,4 . 1995년 임상 증후군으로 처음 보고된 이후 최근의 증거는 7개의 유전자에 돌연변이가 있음을 시사했으며, 모두 이 상태에서 근질 망상(SR) 저장 Ca 2+ 방출에 관여했습니다: 가장 빈번하게 보고된 RYR2 인코딩 리아노딘 수용체 2(RyR2)의 Ca2+ 방출 채널5,6, FKBP12.67, CASQ2 인코딩 심장 calsequestrin8, TRDN 접합 SR 단백질 트리아딘9 및 CALM1
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프로토콜
실험에는 10주 내지 14주령의 수컷 야생형 마우스 또는 무게가 20-25g인 RyR2-R2474S/+ 마우스(C57BL/6 배경)가 사용되었다. 모든 절차는 기관이 운영되는 국가 지침에 따라 중국 쓰촨성 사우스웨스트 의과대학의 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호:20160930)의 승인을 받았습니다.
1. 준비
- 스톡 솔루션
- 블레비스타틴 원액: 100% 디메틸설폭사이드(DMSO) 1mL를 (-) 블레비스타틴 분말 2.924mg이 함유된 원래 플라스크에 넣어 10mM의 농도에 도달합니다.
- 전압 표시기 RH237 원액: 원래 플라스크에 100% DMSO 1mL를 RH237 분말 1mg과 함께 첨가하여 2.01mM의 농도를 달성합니다.
- 칼슘 지시약 Rhod-2 AM 원액: 100% DMSO 1mL를 Rhod-2 AM 분말 1mg에 첨가하여 0.89mM 농도에 도달합니다.
- Pluronic F127 원액: 100% DMSO 1mL를 Pluronic F127 200mg에 첨가하여 20% w/v(0.66mM)의 농도에 도달합니다.
- 반복적인 동결 및 해동을 방지하기 위해 단일 또는 이중 사용을 위해 2....
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결과
광학 매핑은 지난 10년 동안 복잡한 심장 부정맥을 연구하는 데 널리 사용되는 접근 방식이었습니다. 광학 매핑 설정은 EMCCD 카메라로 구성되며 각 픽셀에 대해 최대 1,000Hz의 샘플링 속도와 74 x 74μm의 공간 분해능을 제공합니다. 이를 통해 신호 샘플링 중에 다소 높은 신호 잡음비를 구현할 수 있습니다(그림 1). 랑겐도르프 관류된 심장이 안정된 상태에 도달하고 염료 로딩이 완료되면 심장은 전압 표시기 RH237 및 Ca2+ 표시기 Rhod-2 AM의 여기(excitation)에 사용되는 두 개의 530nm LED 조명 아래 동종 발열 챔버에 배치됩니다. 방출광은 600nm(Ca2+의 경우)와 670nm(V의 경우)의 두 가지 파장으로 나뉘며 EMCCD 카메라를 사용하여 동시에 감지됩니다. 15분 동안 아베르틴과 헤파린을 관류한 후 수술 기구(그림 2A)를 사용하여 흉부를 열고 심장을 빠르게 추출한 다음.......
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토론
우리의 경험에 비추어 볼 때, 쥐 심장의 성공적인 이중 염료 광학 매핑의 핵심은 잘 준비된 솔루션과 심장, 염료 로딩, 최상의 신호 대 잡음비 달성 및 모션 아티팩트 감소입니다.
용액의 준비
크렙스 용액은 성공적인 심장 실험에 필수적입니다. MgCl 2및 CaCl 2 원액 (1 mol / L)은 수분 흡수를 고려하여 미리 준비되고 다른 모든 성분이 순수한 물에 용해 된 후 Krebs 용액에 첨가됩니다. Krebs 용액은 산소화를 보장하기 위해 최소 30분 동안 95% O 2/5% CO2로 기포됩니다. 쥐의 심장은 pH에 특히 민감하기 때문에 산소화 후 용액 pH는 약 7.4여야 합니다. 용액에 작은 입자가 있더라도 이러한 입자가 모세혈관을 차단하고 관류 효과에 영향을 줄 수 있기 때문에 실.......
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공개 사항
저자 중 누구도 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81700308에서 XO로, 31871181에서 ML로, 82270334에서 XT로), 쓰촨성 과학 기술 지원 프로그램 (CN) (2021YJ0206 - XO, 23ZYZYTS0433 및 2022YFS0607 - XT, 2022NSFSC1602 - TC) 및 의약 자원의 화학 및 분자 공학을 위한 국가 핵심 연구소 (광시 사범 대학) (CMEMR2017-B08 - XO)의 지원을 받습니다. MRC(G10031871181 to ML02647, G1002082, ML), BHF(PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE at Oxford(ML) 보조금.
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재료
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| 0.2 &무; m 주사기 필터 | 의료 기기 공장 Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | 여과 용액 |
| 15 mL 원심 분리기 튜브 | Guangzhou Jet Bio-filtration Co., Ltd. 중국 | CFT011150 | |
| 1 mL 파스퇴르 피펫 | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. 중국 | 00900026 | |
| 1 mL 주사기 | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 &뮤; L PCR 튜브 | Sangon Biotech Co., Ltd. 상하이. 중국 | F611541-0010 | Aliquote 재고 솔루션 반복적인 동결 및 해동을 피하기 위해 |
| 50 mL 원심분리기 튜브 | Guangzhou Jet Bio-filtration Co., Ltd. 중국 | CFT011500 | 스토어 Tyrode의 솔루션을 4 ° 후속 심장 격리를 위한 C |
| 585/40nm 필터 | Chroma Technology | 칼슘 신호용 | N/A |
| 630nm 장역 통과 필터 | 크로마 기술 | G15604AJ | 전압 신호용 필터 |
| Avertin(2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | 고통과 통증 반사를 최소화하기 위해 |
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참고문헌
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. P....
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