쥐 모델에서 협측 점막 이식편 요도 성형술에 이은 요도 협착 유도

요약

본 프로토콜에서는 Wistar 쥐에서 요도 협착 유도가 개발되었고, 협측 점막 이식편을 통한 요도 재건이 뒤따랐습니다. 역행성 요도 조영술 및 레이저 도플러 평가를 수행하여 요도 재건(협착 형성 후) 및 이식편 배치를 검증했습니다.

초록

요도 재건술은 비뇨기과 전문의에게 중요한 전문 분야입니다. 협측 점막은 요도 이식이 필요할 때 최선의 선택으로 간주되지만, 경우에 따라 부적절하거나 주어진 협착을 복구하기 위해 최적화해야 합니다. 따라서 혁신적인 절차를 개발하고 실험 모델에서 예상 성공을 평가하는 것은 임상적 요구에 부합하는 데 매우 중요합니다. 이를 위해 본 연구는 Wistar 쥐에서 전기 소작에 의해 요도 협착이 유도된 프로토콜을 설명합니다. 요도 재건술은 1주일 후 협측 점막 이식편을 사용하여 아랫입술에서 채취하고 복부 온레이 방식으로 배치했습니다. 역행성 요도 조영술은 협착 유도 후 각각의 값에 비해 요도 치환술 후 요도 직경이 유의하게 개선되었음을 보여주었습니다. 또한, 이식편 배치는 레이저 도플러를 이용한 혈액 관류 분석으로 평가하였다. 예상대로, 짙은 파란색 영역은 혈관이 없는 협측 점막 이식편에 해당합니다. 이 시술은 협측 점막 이식편을 이용한 요도 재건뿐만 아니라 요도 손상 및 조직 조절의 정상적인 병태생리학적 과정을 재현 가능한 방식으로 성공적으로 시뮬레이션할 수 있으며, 조직 공학 또는 요도 이식편을 기반으로 한 향후 연구의 기초가 될 수 있습니다.

서론

요도 재건술은 협착, 외상 또는 선천적 결함 환경에서 요도 손상을 관리하는 비뇨기과 의사에게 중요한 과제입니다¹. 요도 치환술은 요도 치환술이 필요한 대부분의 환자에게 선택되는 치료법으로, 요도 전방 결손이 길고(>2cm) 요도 치환술이 필요하다². 생식기 또는 생식기 외 부위의 전체 또는 분할 두께의 피부 이식편, 방광 벽 점막 또는 광범위한 협측 점막을 포함한 많은 조직이 요도 대용품으로 사용되어 왔다². 협측 점막 이식편은 습하고 털이 없는 환경에서 자라며, 수확하기 쉽고, 감염에 강하고, 상피가 두껍고, 가성 게실 형성 가능성이 낮고, 얇은 층판으로 조기 흡수 및 접종이 가능하다는 등 여러 가지 장점이 있다³. 피판과 달리 이식편은 혈액 공급이 없으며, 수혜자의 혈관 침대에 따라 생존^4.

이식편 또는 피판의 동물 모델은 수술 기법을 개발 또는 개선하고, 조직 생리학, 기저 메커니즘 및 실패 원인을 연구 및 이해하고, 혁신적인 치료 전략을 평가하는 데 광범위하게 사용되었습니다 ^5,6. 더 큰 동물은 기술적 실행을 용이하게 하지만, 설치류, 즉 쥐와 생쥐는 취급 및 유지 관리가 더 쉽고, 질병에 강하고, 비용 효율적이며, 중요한 것은 분자 메커니즘을 조사하는 도구를 사용하여 혁신적인 치료법을 테스트하는 데 중요합니다 ^5,6. 피판과 이식편은 피부, 뼈, 근육^{6, 혈관}5, 심지어 고형 장기⁷ 등 다양한 조직을 사용하는 쥐에서 기술되었다. 그러나 요도 재건이나 조직 공학을 위한 이식편에 대한 쥐 모델에 대한 연구는 거의 없습니다.

그럼에도 불구하고 중개 과학의 발전은 질병을 모방하는 동물 모델에 의존합니다. 지금까지 국소 병태생리학 환경은 협착 직후 요도 재건술을 시행하기 때문에 다루어지지 않았습니다. 본 연구는 국소 병태생리학 환경에서 협측 점막 이식편을 이용한 요도 재건술을 시행하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해 요도 협착을 재건하기 1주일 전에 유도했다. 쥐에서 수행된 이 실험 모델을 통해 혁신적인 치료법을 테스트하고 향후 분자 메커니즘과 임상적 이점을 조사할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었습니다. 이 절차는 포르투갈 동물 보호 관할 기관인 DGAV의 허가를 받은 기관 동물 복지 기관의 승인을 받았습니다(면허 번호 0421/000/000/2021). 본 연구에서는 생후 12-14주령의 수컷 Wistar Han IGS(Crl:WI(Han) 랫트(400-500g)를 사용하였다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조).

1. 용액 준비

1. 마취액
   1. 3mL 주사기에 2.3mL의 메데토미딘(1mg/mL, 체중 0.715mg/kg)을 채우고 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   2. 3mL 주사기에 펜타닐 1.55mL(0.05mg/mL, 체중 0.02mg/kg)를 채우고 동일한 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   3. 10mL 주사기에 6.15mL의 미다졸람(5mg/mL, 체중 9.5mg/kg)을 채우고 동일한 15mL 원심분리 튜브로 옮겨 10mL 마취액을 만듭니다.
   4. 튜브에 라벨을 붙이고 어두운 곳에서 4 °C로 보관하십시오.
      참고: 이 마취제 조합(메데토미딘, 펜타닐 및 미다졸람)은 최대 3시간의 마취 수술 기간을 제공합니다. 아티파메졸과 플루마제닐의 투여는 효과를 되돌릴 수 있다.
2. 진정 방지 솔루션
   1. 1mL 주사기에 0.7mL의 아티파메졸(5mg/mL, 체중 3.72mg/kg)을 채우고 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   2. 10mL 주사기에 9.3mL의 플루마제닐(0.1mg/mL, 체중 1.56mg/kg)을 채우고 동일한 15mL 원심분리 튜브로 옮겨 10mL 항진정 용액을 만듭니다.
   3. 튜브에 라벨을 붙이고 어두운 곳에서 4 °C로 보관하십시오.
3. 수술 후 진통 솔루션
   1. 1mL 주사기에 0.5mL의 카프로펜(50mg/mL, 체중 5mg/kg)을 채우고 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   2. 9.5mL의 NaCl 용액(0.9%)을 첨가하여 10mL의 카프로펜 용액을 얻습니다.
   3. 1mL 주사기에 1mL의 부프레노르핀(0.3mg/mL, 체중 0.01-0.05mg/kg)을 채우고 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   4. 9mL의 NaCl 용액(0.9%)을 첨가하여 10mL의 부프레노르핀 용액을 얻습니다.
   5. 튜브에 라벨을 붙이고 어두운 곳에서 4°C에 보관하십시오.
4. 수술 전후 항생제
   1. 2.5mL 주사기에 2.5mL의 엔로플록사신(25mg/mL, 체중 10mg/kg)을 채우고 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   2. 7.5mL의 NaCl 용액(0.9%)을 첨가하여 10mL의 엔로플록사신 용액을 얻습니다.
   3. 튜브에 라벨을 붙이고 어두운 곳에서 4 °C로 보관하십시오.
      알림: 위의 용액을 준비하기 위한 모든 시약의 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

2. 요도 협착의 외과적 유도

참고: 수술 절차는 실체 현미경(10x)을 사용하여 수행되었습니다( 재료 표 참조).

1. 메스 블레이드(11번), 뾰족한 집게, 스프링 가위, 수술용 집게, 안과 바늘 홀더, 수술용 가위 및 바늘 홀더와 같은 모든 수술 도구를 사용하기 전에 소독하십시오. 멸균 면봉을 사용하여 수술 부위를 청소하십시오.
2. 쥐를 잡기 전에 주사기에 마취액을 넣으십시오.
3. 튜브나 수건을 사용하여 동물을 제지하고 꼬리를 들어 올려 복부를 노출시킵니다.
4. 동물을 구속하고 마취액의 복강 내 주사를 수행합니다(1.1단계에서 준비).
5. 쥐의 페달 인출 반사를 테스트하여 마취를 평가합니다.
6. 동물의 양쪽 눈에 보호 눈 젤을 바릅니다. 체중 10mg/kg에서 항생제 용액(1.1단계에서 준비)을 피하 주사합니다.
7. 가열된 패드에 쥐를 등쪽 욕창 위치에 놓고 10배 또는 20배 배율의 해부 현미경을 사용하여 수술을 수행합니다.
8. 포비돈 요오드(100mg/mL)로 음경과 주변 복부 피부를 청소합니다.
9. 수동으로 포피를 집어넣고 음경 귀두의 등쪽에 표재성 스테이 봉합사(7.0 봉합사, 재료 표 참조)를 배치하여 음경에 견인을 가하고 바늘 홀더를 제자리에 두어 음경을 수축된 상태로 유지합니다.
10. 윤활제 젤을 사용하여 카테터 삽입을 위해 22G 정맥 카테터를 요도에 삽입합니다.
11. 수술용 메스 칼날(11번)을 사용하여 음경 피부에 1cm 세로 복부 절개를 수행합니다.
12. 뾰족한 집게와 스프링 가위를 사용하여 축도 중간 수준에서 요도가 노출될 때까지 음경 조직층을 절개합니다.
13. 전기 소작 장치 ( 재료 표 참조)를 사용하여 10W의 전류를 1 초 동안 요도의 측면 (양쪽의 한 위치)에 음경의 중간 샤프트 수준에서 복부에 적용합니다.
14. 6.0 흡수성 러닝 봉합사로 절개 부위를 봉합합니다( 재료 표 참조).
15. 요도 카테터를 제거합니다. 음경 견인 봉합사를 제거합니다.
16. 진통의 피하 주사를 실시합니다: 카프로펜은 체중 5mg/kg, 부프레노르핀은 체중 0.03mg/kg입니다.
17. 주사기에 항진정제(1.2단계에서 준비)를 넣고, 복부 욕창 상태에 있는 동물과 함께 느슨한 피부를 천막으로 덮어 항진정제 용액을 피하 주사합니다.

3. 협측 점막 이식편을 이용한 요도 성형술의 수술

참고: 수술 절차는 실체 현미경(10x)을 사용하여 수행되었습니다( 재료 표 참조).

1. 뾰족한 집게, 스프링 가위, 안과 바늘 홀더, 수술용 가위, 바늘 홀더, 모기 집게 3개, 메스 칼날(11번) 등 이 개입에 필요한 모든 수술 도구를 소독합니다. 작은 스폰지를 사용하여 수술 부위를 청소하십시오.
2. 마취제, 항생제, 제지를 투여하고 앞에서 설명한대로 동물을 배치하십시오 (2.2-2.8 단계).
3. 아랫입술의 협측 점막, 음경, 주변 복부 피부를 포비돈 요오드(100mg/mL)로 청소합니다.
4. 아랫입술, 양쪽 및 중간에 3개의 스테이 봉합사(7.0 봉합사)를 배치하고 각 봉합사에 모기를 남겨 아랫입술을 수축시키고 내부 점막을 노출시킵니다.
5. 스프링 가위와 뾰족한 집게를 사용하여 아랫입술 안쪽 협측 점막의 직경 4mm 이식편을 채취하여 멸균 식염수(0.9% NaCl)가 있는 작은 수용체에 넣습니다.
6. 지혈을 위해 스펀지로 기증자 부위를 압박합니다.
7. 이전에 삽입한 아랫입술의 스테이 봉합사를 제거합니다.
8. 앞에서 설명한 대로 음경을 노출합니다(2.9단계).
9. 윤활제 젤을 사용하여 카테터 삽입을 위해 22G 정맥 카테터를 요도에 삽입합니다.
10. 스프링 가위를 사용하여 원주, 관상하 절개를 수행하고 음경을 바닥까지 제거합니다.
11. 뾰족한 집게와 스프링 가위를 사용하여 나머지 층을 해부하고 요도를 노출시킵니다.
12. 수술용 메스 칼날(11번)과 스프링 가위를 사용하여 관상 고랑에서 3mm 원위부에서 시작하여 4mm 연장으로 세로 복부 절개를 수행하고 이전에 유도된 협착 수준에서 요도를 주걱으로 만듭니다(2단계).
13. 주걱의 양쪽에 하나씩 7.0 재질의 스테이 봉합사 2개를 놓고 요도를 수축시키기 위해 각각에 모기를 남겨둡니다.
14. 주걱의 양쪽 끝에 하나씩 두 개의 7.0 비흡수성 봉합사를 놓습니다.
15. 협측 점막 이식편을 복부 온레이 방식으로 배치하고 점막 쪽이 요도 내강을 향하도록 합니다.
16. 이식편 끝을 통해 봉합사 중 하나를 통과시키고 러닝 봉합사로 반타원을 수행합니다.
17. 이식편의 반대쪽에 있는 다른 봉합사로 3.15단계와 3.16단계를 반복합니다.
18. 요도 카테터를 제거합니다. 음경 피부의 위치를 변경합니다.
19. 6.0 흡수성 중단 봉합사로 원주 관상하 절개 부위를 봉합합니다.
20. 음경 견인 봉합사를 제거합니다.
21. 진통제를 투여한 후 2.16-2.17단계에 설명된 대로 항진정제를 투여합니다.

4. 수술 후 모니터링

1. 매시간 3-4회 쥐를 관찰하여 마취에서 회복되었는지 확인합니다. 호흡을 모니터링하고 페달 및 눈 반사를 평가합니다.
2. 48시간 동안 12시간마다 진통제를 피하 주사합니다.
   참고: 카프로펜은 체중 1mL/500mg으로 투여되었고, 부프레노르핀은 체중 0.5mL/500mg으로 투여되었습니다( 재료 표 참조).
3. 각 시술 후 48시간 동안 부드러운 음식을 제공하고 즉시 물을 제공합니다.
4. 수술 후 매일 쥐를 모니터링하고 건강 상태와 수술 부위 모양을 등록합니다. 평가된 징후에는 얼굴 표정, 발성, 활동 상태, 통증 징후, 음식 및 음료 섭취, 배뇨 및 출혈이 포함됩니다.

5. 혈액 관류 평가

알림: 혈류는 협착 유도 직전, 요도 치환술 직전, 요도 치환술 직후에 측정됩니다.

1. 레이저 도플러 관류 이미징을 수행합니다.
   1. 마취액을 사용하여 쥐를 마취합니다(1.1단계).
   2. 2.9단계에서 설명한 대로 음경 견인이 있는 37°C 가열 패드에 쥐를 올려놓습니다.
   3. 레이저 도플러 관류 이미저( 재료 표 참조)를 시작하여 데이터를 얻습니다. 레이저 빔이 읽을 관심 영역을 미리 설정합니다.
   4. 진정 방지액(1.2단계)을 도포하여 마취를 되돌립니다.
   5. 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 음경 영역 주위에 관심 영역(ROI)을 그리고 시간 경과에 따른 플럭스 값을 정합합니다.

6. 방사선 사진 평가

참고: 요도 치환술 후 협착 유도 확인 및 협착 해결은 역행성 요도 조영술로 확인됩니다. 이 평가는 협착 유도 후 1주일(요도 치환술 전)과 요도 치환술 후 2주 후에 수행됩니다.

1. 모노플랜 혈관 조영술 시스템을 사용하여 역행성 요도 조영술을 수행합니다( 재료 표 참조).
   1. 마취액을 사용하여 쥐를 마취하십시오.
   2. 2.9단계에서 설명한 대로 음경 견인이 있는 오른쪽 비스듬한 욕창 상태의 혈관 조영술 매트리스에 동물을 놓습니다.
   3. 원뿔 빔을 음경을 포함한 동물의 골반 부위에 초점을 맞춥니다.
   4. 22G 정맥 카테터를 원위 요도에 2mm 전진시킵니다.
   5. 요오드 방사선 조영제 1mL(623mg/mL 요오프로미드 용액과 0.9% NaCl의 1:1 비율)를 요도에 주입하기 시작합니다.
   6. 동시에 일반 방사선 촬영을 수행하여 요도 내강을 충족하는 방사선 조영제를 식별하고 요도 직경을 평가합니다.
   7. 영상이 완료되면 진정 방지 용액으로 마취를 되돌립니다.

7. 안락사

참고: 안락사는 요도 성형술 후 3주(협착 유도 후 4주), 마지막 관류 평가 직후에 수행됩니다.

1. 2.5mL 주사기에 2mL/kg 펜토바르비탈 나트륨(400mg/mL)을 채웁니다.
2. 동물을 안락사시키기 위해 용액의 복강 내 주사를 수행합니다.

결과

체중 400-500g, 생후 12-14주 된 총 12마리의 수컷 Wistar 쥐를 요도 협착 유도에 사용했습니다. 1주일 후⁸일에 역행성 요도 조영술(RUG1)을 시행하여 이 기술의 성공을 확인했다. 요도 직경은 협착 유도 수준에서 밀리미터 단위로 측정되었습니다. 그 후, 협측 점막 이식편을 이용한 요도 성형술을 쥐 요도의 복측 얼굴에 시행하였다. 동일한 쥐를 요도 치환술 14일 후 두 번째 역행성 요도 조영술(RUG2)에 제출하고 이식편 배치 수준에서 요도 직경을 밀리미터 단위로 측정했습니다. 평균 RUG1 및 RUG2 직경은 각각 1.04mm 및 1.52mm로 요도 투과성이 크게 개선(p < 0,0001)되어 (그림 1) 외과적 개입의 성공과 측정 간의 양호한 일관성을 확인했습니다.

국소 관류는 또한 조직 미세 순환 환경을 모니터링하기 위한 비침습적 방법으로 요도 ...

토론

협측 점막 이식편을 이용한 요도 성형술은 요도 재건술의 중요한 초석입니다. 그러나 합병증과 이환율을 줄이기 위해 이미 설명된 것을 최적화하고 조직 공학 재료 및 생물학적 이식편과 같은 새로운 절차를 확립하기 위해 혁신적인 절차를 개발해야 합니다. 전임상 모델을 확립하고 수술 기법을 정의하기 위한 몇 가지 절차가 발표되었습니다. Souza et ^al.1 은 12마리의 뉴질랜드 토끼를 포함한 연구를 수행했습니다. 복부 세로 피부 절개를 시행하고 요도를 알부기네아에서 동원한 후 요도의 등쪽 부분을 절제하여 결손을 만들었습니다. 동시에 협측 점막 이식편을 뺨에서 채취하여 7-0 흡수성 봉합사로 등쪽 상감으로 배치했습니다. 본 연구에서는 수컷 Wistar 쥐를 사용합니다. 크기가 작기 때문에 기술적으로 더 까다롭지만 다루기는 더 쉽습니다. 요도 협착의 병태생리학과 이식편의 생리학을 모방하기 위해, 이 모델에서는 요도 치환술과 동일한 수술 시간에 수행된 요도 결손과 달리 이전에 요도 협착과 유사한...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아티파메졸	오리온 파르마		항세단(아티파메졸)은 진정제 및 진통 효과를 되돌리기 위해 적응시킨다.
부프레노르핀	리히터파르마		부프레노르핀은 오피오이드 알칼로이드 테베인의 유도체로, 모르핀보다 25-40배 더 강력하고 지속 시간이 더 길어 진통제입니다.
칼 자이스 Opmi-1 FC 외과용 입체 현미경	칼 자이스 현미경, 독일		ZEISS의 OPMI 1 FC는 품질, 정밀도, 신뢰성을 상징합니다. 수동 시스템은 사용하기 쉽고 전설적인 ZEISS 광학 장치를 통해 고해상도 이미지를 제공합니다.
카프로펜	조에티스		카프로펜은 프로피온산계의 비스테로이드성 항염증제(NSAID)입니다.
카테터 22 G. x 1''	B 브라운	인트로캔 안전	동맥 접근을 위해 더 단단한 구조의 플루오린화 에틸렌 프로필렌(FEP) 정맥 카테터>< 삽입.
엔로플록사신	바이엘		엔로플록사신은 플루오로퀴놀론계 항생제입니다.
펜타닐	브라운	3644960	펜타닐은 강력한 합성 오피오이드 진통제입니다.
플루마제닐	프레제니우스 카비		벤조디아제핀 길항제는 벤조디아제핀이 일으키는 진정 효과를 완전 또는 부분적으로 되돌리기 위해 사용됩니다.
고온 소작	피아브	F7244	일회용 소작제, 멸균, 고온(1200 & 도; C), 28mm 미세 팁.
인스틸라겔 젤	파르코-파르마		셀룰로오스 기반 윤활제로, 국소 마취 및 소독 효과가 있습니다.
아이오프로마이드	바이엘		요오드가 포함된 비이온 주입 조영제.
레이저 도플러 영상 시스템 (관류 영상기 moorLDI2-HIR 및 전용 소프트웨어)	무어LDI-V6.0, 무어 인스트루먼트 Ltd, 액스민스터, 영국	5710	혈관신생 모델은 레이저 도플러 영상을 사용해 뒷다리의 혈액 관류를 평가하며, 그 중 하나는 외과적으로 결찰됩니다. 전용 측정 및 비교 소프트웨어를 통해 허혈성 사지와 비허혈성 사지의 혈류 평가 대상 영역을 정의하여 '재관류 비율'을 산출할 수 있으며, 이는 동일 대상자에 대해 며칠에 걸쳐 필요할 때마다 평가할 수 있습니다.
루브리탈 아이 젤	데크라		마취 중 안구 건조증 예방을 위해 동물에게 사용되는 눈 젤. 각막과 결막에 윤활과 보습 작용.
수컷 위스타 한 IGS (Crl: WI(Han) 쥐	스페인 샤를 강 연구소		12주에서 14주 사이의 아기
메테도미딘	버박	037/01/07 RFVPT	메데토미딘은 외과적 마취제로 사용되는 합성 약물입니다.
미다졸람	라베스팔		벤조디아제핀 약물은 마취 및 시술적 진정에 사용됩니다.
모노플랜 혈관조영 시스템	필립스 메디컬 시스템즈	아주리온 7 M20	심장, 뇌 및 기타 장기, 림프계의 혈관과 기능을 시각적이고 정량적으로 평가할 수 있도록 최적화하기 위해 설계된 고정식 진단용 형광투시 엑스레이 시스템입니다.
모기 겸자	헨리 샤인	102-4346	하트만-모스키토 정혈 겸자 곡선 3-1/2" 스테인리스 스틸
바늘 홀더	헨리 샤인	100-2570	바늘 홀더 마요-헤가르, 스테인리스 스틸, 14cm
안구용 바늘 홀더	아시코	AE-6143	바늘걸이 배랑커, 자물쇠 없이 가장 섬세한 장치
펜토바르비탈 나트륨	에쿠파르		펜토바르비탈 나트륨은 안락사에 사용되는 펜토바르비탈의 나트륨염입니다.
뾰족한 겸자	아스쿨라프	BD335R	마이크로포셉, 0.30mm 팁
폴리소브 6.0	메드트로닉 (코로디엔)	UL-101	코팅된 합성 흡수성 봉합사는 조직 내 염증 반응을 줄이고, 이어서 섬유성 결합 조직으로 봉합선을 점진적으로 감싸는 것을 목표로 했습니다.
프로비돈-요오드	마일란		포비돈-아이오딘 10%는 소독제로, 수술 전후에 소독제로 사용됩니다.
스칼펠 블레이드 nº 11	B 브라운	BB511	탄소강, 멸균
스프링 가위	헨리 샤인	600-4826	수술용 가위 31 castroviejo
외과용 겸자	아스쿨라프	BD33R	마이크로포셉, 0.20mm 팁
수술용 가위	아스쿨라프	MA873R	마이크로 아이리스 가위, 곡선 슈랩 팁
서지프로 7.0	메드트로닉 (코로비든)	VP-702-X	일반 연조직 결찰에 사용되는 비흡수성 모노필라멘트 폴리프로필렌 봉합사가 적합합니다.