Method Article

PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy를 통한 Crocetin에 의한 산화 스트레스로부터 H9c2 심근 세포 보호

DOI:

10.3791/65105

⸱

May 26th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2Fangshan Chinese Medicine Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

In This Article

Summary

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시험관 내 실험을 기반으로 한 이 연구는 PINK1/Parkin 신호 전달 경로가 중요한 역할을 하는 미토파지에 영향을 미쳐 심근 세포의 산화 스트레스 손상을 복구하는 크로세틴의 메커니즘을 밝혔습니다.

Abstract

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본 연구는 체외 실험을 통해H2O2매개 H9c2 심근세포에 대한 크로세틴의 산화적 스트레스 보호 효과를 탐색하고, 그 기전이 미토파지의 영향과 관련이 있는지 여부를 추가로 탐색하는 것을 목표로 하였다. 이 연구는 또한 심근 세포의 산화 스트레스에 대한 홍화산의 치료 효과를 입증하고 그 메커니즘이 미토파지의 효과와 관련이 있는지 여부를 탐색하는 것을 목표로 했습니다. 여기서는H2O2기반 산화 스트레스 모델을 구축하고, 젖산 탈수소효소(LDH), 크레아틴 키나아제(CK), 말론디알데히드(MDA), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 카탈라아제(CAT), 글루타티온 퍼옥시다아제(GSH Px)의 수준을 검출하여 심근 세포의 산화 스트레스 손상 정도를 평가하였다. 활성 산소 종(ROS) 검출 형광 염료 DCFH-DA, JC-1 염료 및 TUNEL 염료를 사용하여 미토콘드리아 손상 및 세포자멸사를 평가했습니다. 자가포식 플럭스는 Ad-mCherry-GFP-LC3B 아데노바이러스를 형질감염시켜 측정하였다. 그런 다음 Mitophagy 관련 단백질을 웨스턴 블로팅 및 면역형광을 통해 검출했습니다. 그러나 크로세틴(0.1-10μM)은 세포 생존율을 크게 향상시키고H2O2로 인한 세포자멸사 및 산화 스트레스 손상을 감소시킬 수 있습니다. 자가포식 활성화가 과도한 세포에서 크로세틴은 자가포식 흐름과 미토파지 관련 단백질 PINK1 및 Parkin의 발현을 감소시키고 Parkin이 미토콘드리아로 전달되는 것을 역전시킬 수 있습니다. 크로세틴은H2O2매개 산화 스트레스 손상과 H9c2 세포의 세포자멸사를 감소시킬 수 있으며 그 메커니즘은 미토파지와 밀접한 관련이 있습니다.

Introduction

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급성 심근경색증(Acute myocardial infarction, AMI)은 관상동맥에 대한 심각하고 지속적인 허혈 및 저산소증에 의해 유발되는 생명을 위협하는 심근 괴사이다 1,2. 경피적 관상동맥 중재술(PCI)은 AMI의 1차 치료 전략 중 하나이며, 일반적으로 허혈성 손상으로부터 심근세포를 보호한다 3,4. 원위 심근은 AMI 후 신속하고 효과적으로 치료하지 않으면 혈액과 산소 공급이 부족하여 허혈성 괴사와 심혈관 합병증을 유발합니다 5,6. PCI 수술 기회를 놓친 후 심근 세포 회복을 촉진하고 돌이킬 수 없는 심근 손상을 최소화하는 것은 연구 핫스팟이었습니다. AMI 후, 심근 세포는 허혈 및 저산소증 상태에 있으며, 그 결과 미토콘드리아 산화적 인산화가 억제되고, NAD+가 NADPH로 환원되며, 단일 전자 환원이 증가한다7. 그 결과, 산소의 불완전한 환원 반응은 과량의 활성산소종(ROS)을 생성하고, 궁극적으로 심근세포에....

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Protocol

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실험은 중국 베이징 중의과 대학의 생리학 실험실에서 수행되었습니다. 모든 연구 방법은 베이징 대학의 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 세포 배양

  1. 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 기본 배지(4.5g/L D-포도당, 4.g.g/L L-글루타민 및 110mg/L 피루브산나트륨 포함, 재료 표 참조)에 추가하여 DMEM 완전 배지를 준비합니다.
  2. 액체 질소 동결 H9c2 심근 세포( 재료 표 참조)를 37°C의 따뜻한 물에서 얼음이 녹을 때까지 빠르고 균일하게 저어줍니다.
  3. 세포를 원심분리기 튜브로 옮기고 DMEM 완전 배지 부피의 4배를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 358 x g 로 원심분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 버린다.
  4. 수득한 세포 현탁액을 배양액으로 희석하고, 부드럽게 불어, 배양 플라스크에 세포를 접종한다. 5%CO2와 함께 37°C의 인큐베이터에서 배양한다.

2. 세포 생존율 측정

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Results

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세포 생존율에 대한 크로세틴의 효과
0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM 및 100 μM의 크로세틴은 세포에 상당한 증식 효과를 보인 반면, 200 μM 이상의 농도에서 크로세틴은 H9c2 세포의 증식을 유의하게 억제했습니다(그림 1A). 400 μM H 2 O2로 4 시간 처리 한 후, 세포 생존율은 상당히 감소되었고, 크로세틴은 이러한 변화를 어느 정도 되돌릴 수 있었다 (도 1B). H2O2 유도 H9c2 세포 생존율에서 10μM과 100μM 크로세틴 사이에 유의미한 차이가 관찰되지 않았기 때문에 10μM 크로세틴을 고농도로, 1μM 및 0.1μM을 각각 중용량 및 저용량 그룹으로 사용하였다.

H9c2 세포.......

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Discussion

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첨단 기술을 통해 천연 약물의 복잡한 화합물에서 유효 성분을 탐색하는 것은 TCM 연구29의 핫스팟이었으며 검증 후 향후 약물 개발을 위한 실험실 증거를 제공할 수 있습니다. 홍화는 "혈액 순환을 촉진하고 혈액 정체를 최소화하는"치료의 대표적인 약물이며 심근 경색 치료에 널리 사용됩니다30,31. 사프란은 홍화와 유사한 효과가 있는 것으로 여겨지며 혈액 순환을 촉진하고 혈액 정체를 제거하는 효과가 홍화보다 훨씬 우수합니다31,32. 크로세틴은 사프란33의 주요 활성 성분 중 하나이므로이 실험의 연구에 사용되었습니다.

H2O2는 심근 세포의 산화 스트레스 손상을 유발하고.......

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Disclosures

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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

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이 연구는 베이징 자연 과학 재단 (No. 7202119)과 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 82274380)의 지원을 받았다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% 트립신 Gibco2323363
1% 페니실린-스트렙토마이신시그마V900929
5x 단백질 로딩 버퍼베이징 풀릴라이 유전자 기술B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B 아데노바이러스BeyotimeC3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. 중산 골든 브릿지 생명 공학 Co., Ltd.ZF-0514
Alexa Fluor 594 활용 염소 안티 마우스 IgG (H + L)Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZF-0513
무동물 차단 솔루션CST15019s
Anti-Parkin 항체Santa Cruzsc-32282
Anti-PINK1 항체ABclonalA11435
Anti-TOM20 항체ABclonalA19403
Anti-β-actin  항체ABclonalAC026
BCA 단백질 분석 키트KeyGEN BiotechKGP902
혈액 세포 계수 플레이트ServicebioWG607
CAT 분석 키트난징 Jiancheng 생명 공학 연구소A007-1-1
화학 발광 검출 시스템상하이 Qinxiang 과학 기기 공장ChemiScope 6100
CK 분석 키트난징 Jiancheng 생명 공학 연구소A032-1-1
코엔자임 Q10 (CoQ 10)MacklinC6129
CrocetinChengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.RFS-Z01802006012
DAPI 함유 항형광 담금질 정제Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZLI-9557
DCFH-DABeyotimeS0033S
DMSOSolarbioD8371
Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)Gibco8122091
ECL(Enhanced Chemiluminescence) 솔루션NCM BiotechP10100
소 태아 혈청(FBS)Corning-Cellgro35-081-CV
그래프패드 프리즘 7.0 https://www.graphpad.com/
GSH-Px 분석 키트Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA005-1-2
H9c2 심근 세포Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.CS0062
양고추냉이 과산화효소(HRP)-활용 염소 항염소 IgG(H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. 중산 골든 브릿지 생명 공학 Co., Ltd.ZB-2305
양고추냉이 과산화효소(HRP)-활용 염소 항-마우스 IgG(H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. 중산 골든 브릿지 생명 공학 Co., Ltd.ZB-2301
JC-1 미토콘드리아 막 전위 분석 키트LABLEADJ22202
LDH 분석 키트Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA020-2-2
MDA 분석 키트Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA003-2-2
메탄올알라딘A2114057
MTS 분석PromegaG3581
PerhydrolG-cloneCS7730
인산가수분해효소 억제제CWBIOCW2383
폴리브레렌BeyotimeC0351
폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인MilliporeISEQ00010
방사성 면역침전 분석법(RIPA) 용해 완충액SolarbioR0010
SDS-PAGE 젤Shanghai Epizyme Biomedical TechnologyPG112
SDS-PAGE 실행 버퍼 분말ServicebioG2018-1L
SDS-PAGE 전송 버퍼 분말ServicebioG2017-1L
SOD 분석 키트Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-2-2
Tris 완충 식염수 분말ServicebioG0001-2L
Triton X-100SigmaSLCC9172
TUNEL apoptosis 분석 키트BeyotimeC1086
Tween-20SolarbioT8220

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
  3. Abbate, A., et a....

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