방법 논문

Ferritinophagy: 인간 섬유아세포에서 자가포식에 의한 철의 선택적 분해 평가

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DOI:

10.3791/65110

⸱

2024년 2월 23일

 , 
1Interfaculty Institute of Cell Biology, Eberhard Karls University Tübingen

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 일차 피부 유래 인간 섬유아세포에서 고처리량, 면역형광 기반 페리티노파지 평가를 수행하기 위한 자세한 지침을 제공합니다.

초록

자가포식 유전자 WDR45/WIPI4 의 돌연변이는 환자의 뇌에 철분 침착물이 존재하기 때문에 뇌 철 축적을 동반한 신경 퇴행(NBIA)으로 알려진 인간 질병의 하위 유형인 베타 프로펠러 관련 신경 퇴행(BPAN)의 원인입니다. 세포 내 철분 수치는 페리티노파지(ferritinophagy)의 중요한 메커니즘을 포함한 여러 세포 메커니즘에 의해 엄격하게 조절됩니다. 이 논문은 원발성 피부 유래 인간 섬유아세포에서 페리티노파지를 어떻게 평가할 수 있는지 설명합니다. 이 프로토콜에서는 세포 수준에서 페리티노파지를 유도하거나 억제하기 위해 철 조절 조건을 사용합니다(예: 리소좀 기능을 억제하기 위해 bafilomycin A1을 투여하고 철을 과부하 또는 고갈시키기 위해 구연산철암모늄(FAC) 또는 디페라시옥스(DFX) 처리를 각각 시행합니다. 그런 다음 처리된 섬유아세포는 내인성 페리틴 및 자가포식체/리소좀 마커(여기서는 LAMP2)에 대한 고처리량 이미징 및 CellProfiler 기반 정량적 국소화 분석을 받습니다. 자가포식체/리소좀 페리틴(autophagosomal/lysosomal ferritin) 수준에 따라 페리티노파지(ferritinophagy) 수준에 대한 결론을 도출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 BPAN 환자 유래 일차 섬유아세포 또는 기타 유형의 포유류 세포에서 페리티노파지를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

WIPI(WD-repeat interacting with phosphoinositides) 단백질은 자가포식1에서 뚜렷한 역할을 하는 진화적으로 보존된 PI3P effector입니다. 4개의 인간 WIPI 단백질(WIPI1에서 WIPI4까지)은 프로펠러의 반대쪽 부위에 상동 아미노산과 불변 아미노산이 모여 있는 진화적으로 보존된 두 개의 영역이 있는 7개의 블레이드 β 프로펠러로 접힙니다. 한 부위는 프로펠러 블레이드 5와 블레이드 6의 포스포이노시타이드 결합 영역과 정렬되어 있습니다. 다른 부위는 WIPI가 자가포식 기계(autophagy machinery) 또는 자가포식 조절 인자(autophagy regulatory factor)의 별개의 구성원과 연관하는 단백질-단백질 상호작용 영역(protein-protein interaction region)과 일치한다2.

WIPI4는 에너지 중심의 자가포식 조절을 제어하고 성장하는 초기 자가포식체의 크기를 조절하는 수준에서 기능한다3. WDR45라고 하는 WIPI4 유전자의 돌연변이는 인간 환자에서 뇌 철 축적(NBIA) 아형을 동반한 신경 퇴행인 베타 프로펠러 관련 신경 퇴행(BPAN)의 원인이며, 흑질 및 구강 팔리두스4에서 저강도 철 후광을 특징으로 합니다. BPAN 환자에게 비정상적인 철분 침착이 존재하면 신경 손상이 발생하여 뇌병증, 전반적 발달 지연, 발작, 그리고 궁극적으로 파킨슨병, 치매 및 경련으로 이어진다5.

철 항상성(Iron homeostasis)은 여러 세포 메커니즘에 의해 엄격하게 조절되며, 세포질 철의 농도는 철 운반체, 철 수송체 및 철 저장 단백질의 발현 수준과 기능에 의해 조절됩니다6 . 세포질 철의 농도는 차례로 페리티노파지(ferritinophage)7 또는 산화된 페리틴8 의 프로테아좀 청소(proteasomal clearance)와 같은 분해 경로가 관련되어 있는지 여부를 결정합니다.

페리티노파지(ferritinophagy) 동안, 페리틴은 화물 수용체 NCOA4에 의해 자가포식소체에 선택적으로 모집되고 낮은 세포 내 철분 수치에 반응하여 리소좀 분해를 표적으로 한다7. 자가포식막(autophagosomal membrane)3의 크기를 조절하는 WIPI4의 역할을 감안할 때, 이 특정 기능의 손실이 자가포식체에서 페리틴의 선택적 격리에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 페리티노파지(ferritinophagy)에 영향을 미칠 수 있다고 예측하는 것이 합리적이다. 철분 대사의 이 핵심 단계를 연구하는 것은 BPAN 환자를 위한 치료 옵션의 문을 열 수 있습니다. 그러나 인간 세포에서 페리티노파지를 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 프로토콜은 이제야 개발되고 있습니다.

이 논문은 인간 세포에서 페리티노파지를 평가하기 위한 고처리량 형광 기반 방법에 대해 설명합니다. 이 분석을 환자 유래 BPAN 세포에 적용하면 페리티노파지가 건강한 인간 세포와 어떻게 다른지에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있으며 이 희귀한 인간 질병의 기저에 있는 분자 메커니즘을 이해하기 위한 벤치마크 역할을 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 일차 세포 배양 및 파종

  1. 액체 질소 탱크에서 얼린 세포가 들어 있는 바이알을 꺼내 세포 배양실에 도달할 때까지 얼음 위에 보관합니다. 이전에 멸균된 후드에서 바이알을 손에 들고 세포 현탁액이 해동되도록 합니다. 세포를 재현탁하고 10% 태아 송아지 혈청(FCS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)이 있는 9mL의 예열된 DMEM이 있는 10cm 세포 배양 플레이트로 옮깁니다. 세포가 플레이트에 고르게 분포되도록 부드럽게 흔들고 37 ° C 및 5 % CO2 에서 밤새 배양 합니다
  2. 다음 날 아침에 셀을 보고 부착되어 있는지 확인합니다. 배지를 신선한 DMEM + 10% FCS + 1%P/S로 변경하고 세포가 80% 밀도에 도달할 때까지 성장하도록 합니다.
  3. 배양 배지를 제거하고 DPBS로 2배 세척하고 플레이트에 트립신 1mL를 넣고 37°C 및 5%CO2 에서 10분 동안 배양합니다. 플레이트에 9mL의 DMEM + 10% FCS를 추가하고 세포를 재현탁시킵니다.
  4. 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. Neubauer 챔버를 사용하여 세포 수를 수동으로 측정하고 세포 농도가 40,000 cells/mL가 될 때까지 세포 현탁액을 DMEM + 10% FCS로 희석합니다.
  5. 유리 바닥 96웰 플레이트에서 세포 현탁액의 100μL/웰을 파종합니다. 37 °C 및 5 % CO2 에서 16 시간 동안 배양합니다.

2. 트리트먼트

  1. 재료 표에 따라 다음 처리를 준비합니다: 철 킬레이트화를 위한 대조 매체, 대조 매체 및 DFX(Deferagiox) 또는 철 로딩을 위한 대조 매체 및 구연산철 암모늄(FAC). 페리티노파지 플럭스를 평가하기 위해 리소좀 억제제(bafilomycin A1)의 존재 여부와 관계없이 모든 치료법을 준비합니다.
  2. 플레이트에서 배양 배지를 제거하고 해당 처리(100μL/웰)로 교체합니다.
  3. 37 °C 및 5 % CO2 에서 6 시간 동안 배양합니다.

3. 고정 및 염색

  1. 처리 매체를 흡입하고 DPBS(Table of Materials)로 2회 세척합니다.
  2. 웰당 100μL의 3.7% 파라포름알데히드(PFA, Table of Materials)를 추가합니다. 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 셀을 고정합니다.
  3. PFA를 제거하고 PBS/T(Table of Materials)로 셀을 2번 세척합니다.
  4. 1% 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 PBS/T에서 4°C에서 1시간 동안 차단합니다.
  5. PBS/T (ferritin 항체 1:50, LAMP2 항체 1:50)에 1차 항체 (Table of Materials) 혼합물을 준비합니다.
  6. PBS/T로 세포를 2배 세척하고 웰당 50μL의 항체 혼합물을 적용합니다. 플레이트를 파라필름으로 감싸고 4°C에서 밤새 배양합니다.
  7. 다음 날 아침, PBS/T에서 2차 항체(Table of Materials) 혼합물(1:200)을 준비합니다.
  8. PBS/T로 세포를 2배 세척하고 웰당 50μL의 2차 항체 혼합물을 적용합니다. 4 °C에서 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다.
  9. 실온 PBS에서 5 μg/μL 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Table of Materials) 용액을 준비합니다.
  10. PBS/T로 세포를 2번 세척하고 100μL/웰의 DAPI 염색을 추가합니다. 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 배양합니다.
  11. PBS로 세포를 2배 세척하고 각 웰에 50μL의 PBS를 추가합니다. 플레이트를 파라필름으로 감싸고 어두운 곳에서 4°C에서 보관합니다.

4. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용한 자동 이미징

  1. 플레이트의 PBS를 실온에서 50μL의 신선한 PBS로 교환합니다.
  2. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 현미경 검사실로 가져갑니다.
  3. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 켜고, 현미경 테이블에 96웰 플레이트용 샘플 홀더를 설정하고, 적절한 대물렌즈(여기서는 40x)를 선택합니다. 자세한 내용은 표 1 을 참조하십시오.
  4. 이미징 설정을 조정합니다(표 1).
    1. Smart Setup에서 레이저와 필터를 선택하고 최적의 이미지 품질과 속도를 위해 트랙(트랙 1-3)에 할당합니다(표 1).
    2. 실험 유형을 선택할 때 타일을 클릭하여 플레이트에서 결정된 X,Y 위치를 선택하고 저장하는 옵션을 활성화합니다.
    3. Imaging Setup 모듈에서 수집 채널, 획득 채널에 할당된 트랙, 여기(excitation) 및 방출 파장(emission wavelength)을 시각화합니다(표 1).
    4. Acquisition Mode 모듈에서 다음을 선택합니다: 스캔 속도: 6; 방향: 양방향; 평균: 2x; 픽셀당 비트 수: 8.
    5. 채널 모듈에서 각 채널의 레이저 출력, 핀홀 및 마스터 게인을 개별적으로 조정합니다(표 2). 이러한 매개변수를 미세 조정하여 과포화 없이 적절하게 노출된 이미지를 얻을 수 있습니다.
    6. 포커스 전략 모듈을 클릭합니다.
      1. 소프트웨어 자동 초점과 명확한 초점 결합을 선택합니다.
      2. 참조 채널 및 오프셋에서 가장 안정적이고 밝은 채널을 참조로 선택합니다(일반적으로 DAPI 또는 488nm).
      3. Stabilization Event Repetitions and Frequency(안정화 이벤트 반복 및 빈도)에서 Standard(표준)를 선택합니다.
    7. 소프트웨어 자동 초점 모듈에서 다음을 선택합니다. 모드 | 강렬; 검색 | 똑똑한; 샘플링 | 벌금; 상대 범위.
    8. 타일 모듈을 클릭합니다.
      1. 위치 | 단일 위치를 선택합니다.
      2. Advanced Setup(고급 설정)에서 플레이트를 탐색하고 이미징할 위치를 식별한 다음 Position Setup(위치 설정) 탭 아래의 + 버튼을 클릭합니다.
      3. 이미지 메타데이터에 기록될 추가 정보로 각 위치에 레이블을 지정합니다. 이렇게 하려면 속성 탭을 열고, 범주 드롭다운 메뉴 옆에 있는 휠 아이콘을 클릭하고, 새로 만들기를 클릭하여 새 범주 이름을 입력할 새 대화 상자를 엽니다. 특정 위치에 범주를 할당하려면 위치를 선택하고 속성 탭을 클릭한 다음 범주 드롭다운 메뉴로 이동하여 해당 레이블을 선택합니다.
        참고: 각 치료에 대한 범주를 만들어 세포가 받은 치료로 각 위치에 레이블을 지정하는 것이 좋습니다.
      4. Sample Carrier(샘플 캐리어)에서 Multiwell 96-Cellvis glass bottom #0을 선택합니다. Calibrate(보정)를 클릭하여 플레이트 표면에 맞게 현미경을 보정합니다. 시스템 사양에 따라 1점 또는 7점 교정 중에서 선택하십시오.
      5. 옵션에서 10%의 타일 겹침을 선택합니다. Travel in Tile Regions(타일 영역에서의 이동)에서 Comb(콤)을 선택합니다. 스테이지 컨트롤에서 스테이지 속도 사용, 스테이지 컨트롤에서 스테이지 가속 사용, 획득 중 이미지 피라미드 사용을 선택합니다.
  5. 이미지 획득을 실행하고 이미지 결과(czi 파일)와 이미지 메타데이터(csv 파일)를 휴대용 하드 드라이브에 저장합니다.
  6. 이미지를 TIFF 파일로 내보냅니다.

5. 고처리량 이미지 분석

  1. Position, Well, Condition, Series 및 Set 열이 있는 별도의 메타데이터 스프레드시트 파일을 만듭니다. 이러한 열을 채우는 데 적합한 데이터는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경에서 가져온 원본 메타데이터 파일에서 검색됩니다.
  2. 오픈 소스 소프트웨어 CellProfiler 4.2.4 (https://cellprofiler.org/previous-releases)를 다운로드합니다.
  3. 두 번 클릭하여 CellProfiler 4.2.4를 시작하고 드래그 앤 드롭으로 CellProfiler 파이프라인(추가 파일 1)을 가져옵니다.
    참고: DAPI 염색(모듈 1, 핵 인식, 표 2 참조) 및 AF488에서 유래한 단일 세포의 배경 형광(모듈 2, 세포 인식, 표 2 참조)을 사용하여 섬유아세포를 자동으로 인식하기 위해 CellProfiler 파이프라인(보충 파일 1)을 컴파일하는 단계를 아래에서 확인하십시오. Puncta(물체라고 함) 인식은 puncta 크기와 배경에 대한 puncta 형광 강도에 의해 결정됩니다(모듈 3, puncta 인식, 표 2 참조). 마지막으로, 셀 경계에 따라 소프트웨어가 인식한 점이 해당 셀에 할당됩니다(관계 할당). 자가포식 연구를 위해 CellProfiler 파이프라인을 구현하는 방법에 대한 자세한 설명은 이전에9. 또한, 표 2는 본 연구에서 사용된 CellProfiler 설정을 포함하고 있다. 또한, 보충 파일 2는 CellProfiler 파이프라인(보충 파일 1)을 표 2에 자세히 설명된 모듈을 참조하여 연속적으로 촬영된 스크린샷과 함께 표시합니다.
  4. CellProfiler 파이프라인(보충 파일 1)을 조정하기 전에 개별 .czi 이미지 파일 또는 여러 .czi 이미지 파일이 포함된 폴더를 이미지 모듈로 끌어다 놓습니다.
  5. 이미지 인식 파이프라인을 사용자 지정합니다. Names and Types 모듈에서 c1-c3 코드를 소프트웨어가 분석할 단일 채널 이미지를 식별하고 정렬할 수 있는 코드로 바꿉니다.
  6. 모듈의 숫자 항목을 최적화하여 IdentifyPrimaryObjects 및 IdentifySecondaryObjects 모듈에 대한 파이프라인 설정을 조정합니다. 본 연구에서 사용된 값은 표 2에 제시되어 있다.
  7. 조정 사항을 추적하려면 테스트 모드 시작 버튼을 클릭하여 테스트 모드 옵션을 선택합니다. 그런 다음 모듈 사이의 단계 버튼을 클릭합니다. 팝업 창(원본 입력 이미지, 원본 이미지 위에 그려진 인식 윤곽선, 분석 결과)이 표시될 때까지 기다립니다. 방금 입력한 설정으로 이미지를 분석하는 방법을 보여줍니다.
  8. 파이프라인이 최적화되면 테스트 모드를 종료합니다. 테스트 모드 종료를 활성화한 다음 이미지 분석 버튼을 클릭하여 분석을 실행합니다.
  9. 분석이 완료되면 입력 이미지를 CellProfiler에서 생성된 오버레이 출력(셀 경계, puncta)과 비교하여 셀 및 반점 검출의 정확도를 확인합니다. 만족스럽지 않으면 분석 결과가 충분히 정확해질 때까지 다른 모듈(표 2)의 수치 값을 조정하십시오.

6. 데이터 분석

  1. 해석을 실행한 후 소프트웨어가 결과가 포함된 테이블 형식의 텍스트 파일 세트를 생성할 때까지 기다립니다. 제공된 CellProfiler 파이프라인(보충 파일 1)을 사용하는 경우 다음 출력 파일을 찾습니다.
    1. CellProfilerOutputCells 파일 - 소프트웨어에서 할당한 이미지 번호, 단일 셀에 할당된 셀 번호, 원본 파일 이름, 파일이 저장된 위치를 나타내는 경로, 셀당 반점(페리틴, LAMP2) 수, 셀당 평균 반점 면적(페리틴, LAMP2)을 나열합니다.
    2. 실험과 관련된 기술적 세부 정보(예: 소프트웨어 버전, 이미지 채널, 메타데이터 태그)에 대한 정보를 제공하는 CellProfilerOutputExperiment 파일.
  2. 이러한 파일을 스프레드시트로 엽니다.
  3. 선호하는 통계 소프트웨어(Table of Materials)를 사용하여 puncta counts 및 puncta co-localization numbers에 대한 통계 분석을 수행합니다.

결과

건강한 기증자(그림 1A)의 인간 피부 유래 1차 섬유아세포(F-CO-60)는 바플로마이신 A1 처리를 사용한 후 내인성 페리틴 및 LAMP2의 면역염색, 자동 이미지 분석 및 CellProfiler 기반 분석을 사용하여 페리티노파지 평가를 위해 준비되었습니다(그림 1B).

내인성 페리틴과 LAMP2의 공동 국소화는 페리틴의 리소좀 분해가 바필로마이신 A1의 첨가에 의해 차단된 후 증가했으며, 이는 리소좀 V-ATPase 효소를 억제하여 페리티노파지를 차단하는 능력과 일치합니다7 (그림 2). 또한 소프트웨어 기반 세포 인식과 페리틴 및 LAMP2 인식이 예시로 나와 있습니다(그림 2).

이와 관련하여, 여기에 설명된 CellProfiler 파이프라인은 매우 다재다능하며, 기능적 단세포 마커 시스템의 맥락에서 세포 성장, 미토콘드리아 또는 기타 소기관에 대한 특정 BPAN 돌연변이의 영향을 평가하는 것과 같은 추가 및/또는 대체 판독에 적용할 수 있다는 점에 유의해야 합니다.

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그림 1: 실험적 개요. 이 프로토콜에 설명된 대로 (A) 페리티노파지 과정 및 (B) 이 프로토콜에 설명된 대로 원발성 피부 유래 인간 섬유아세포에서 페리티노파지를 평가하기 위한 실험적 워크플로우를 그래픽으로 표현합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 대표 이미지. (A) bafilomycin A1이 없거나 (B) 존재하는 대조 배지(공급 조건)에서 1차 피부 유래 인간 섬유아세포는 항-페리틴 및 항-LAMP2 항체를 사용하여 간접 면역형광 분석을 받았고 세포핵은 DAPI로 염색되었습니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 자동화로 획득한 예시적인 형광 이미지가 제시됩니다(스케일 바: 10 μm). 페리틴 및 LAMP2 풍부도 및 공동 국소화의 변화는 바필로마이신 A1 투여에 대한 리소좀 억제 시 관찰될 수 있었습니다. 세포 인식(보라색), 핵(파란색), 페리틴(녹색), LAMP2(빨간색) 및 페리틴/LAMP2(노란색) 푼크타의 소프트웨어 파생 이미지 오버레이를 보여주는 CellProfiler 기반 분석도 표시됩니다. (C) 확대된 이미지 섹션(스케일 바 = 10μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 이 연구에 사용된 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 설정. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 이 연구에 사용된 수치 CellProfiler 설정. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 이 연구에 사용된 CellProfiler 파이프라인. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: CellProfiler 파이프라인(보충 파일 1 참조)과 연속된 순서로 촬영한 스크린샷 표시(표 2 참조). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 방법은 개방형 CellProfiler 기반이미지 분석9과 결합된 자동 형광 현미경을 사용하여 주요 페리티노파지 인자의 세포 내 국소화를 평가하며, 페리티노파지(ferritinophagy)7라고 하는 선택적 자가포식(selective autophagy)을 통한 리소좀 페리틴 제거율의 효능에 대한 귀중한 정보를 제공하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜을 사용하면 여러 세포주와 처리가 동시에 포함된 대규모 샘플 세트를 처리할 수 있으며, 페리티노 플럭스를 평가하기 위한 전형적인 리소좀 마커인 LAMP2와 함께 페리틴 푼타 수 및 페리틴 푼타 수와 같은 원하는 판독값을 평가할 수 있습니다. 그러나 여기서 강조해야 할 점은 정확하고 자동화된 이미지 분석은 이미지 품질에 달려 있으며, 이는 다시 항체 특이성과 최적의 이미징에 달려 있다는 것입니다. 따라서 소프트웨어 기반 이미지 분석은 고품질 이미지로만 수행해야 합니다.

세포의 철분 수치 조절은 질병의 맥락에서 철분 항상성을 조절하기 위해 활성화되는 메커니즘에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 논문은 철 부하 및 철 킬레이트제로 처리된 환자 유래 세포에서 BPAN 질환을 연구하는 방법을 설명합니다. Deferasiox (DFX)는 분야에서 광범위하게 사용되는 알려진 철 킬레이트입니다10. 바르면 유리 철분을 세포질에 가두고 철분 결핍에 대한 세포 반응을 유발합니다. 이 연구의 목적은 페리티노파지(ferritinophagy)를 평가하는 것이었기 때문에 세포에서 철분을 박탈하는 것은 세포의 철 풀을 보충하기 위한 보상 메커니즘으로 자가포식을 통해 페리틴 분해를 촉진하는 간단한 방법이었습니다. 반대로 구연산 철 암모늄 (FAC)은 철로 셀을로드하는 데 사용됩니다. 세포는 과도하고 따라서 독성이 있는 세포질 철 농도에 대한 반응으로 페리틴 합성을 활성화합니다11. 따라서 시트르산 제2철암모늄은 페리틴 합성과 페리틴 헤테로폴리머 내 철의 포획을 촉진하여 페리티노파지를 활성화할 수 있습니다.

페리티노파지 플럭스를 연구하기 위해 이 프로토콜에서는 공정의 핵심 플레이어인 페리틴과 리소좀(여기서는 LAMP2로 표시)을 선택적으로 염색하고 이들의 공동 국소화를 평가합니다. colocalizing puncta의 높은 비율은 페리틴의 효과적인 리소좀 분해를 나타냅니다. 이러한 실험에서 검색된 정보를 최대화하기 위해 추가 염료 또는 마커 항체를 사용할 수 있습니다.

주목할 점은 이 방법에는 기술적인 문제가 내재되어 있다는 것입니다. 다른 인간 기증자로부터 유래한 원발성 섬유아세포는 체외에서 다르게 증식하고 성장할 수 있습니다. 따라서 비교 가능한 결과를 얻으려면 동일한 통로에 다른 셀을 파종해야 합니다. 따라서, 사용될 세포 또는 세포주의 배가시간을 검사하기 위해 이 프로토콜을 진행하기 전에 테스트 실험을 수행하는 것이 바람직하다.

이 방법은 ferritinophagy 연구에만 국한되지 않습니다. 사용된 치료법과 항체를 단순히 변경함으로써 다양한 다른 선택적 자가포식 경로를 평가하기 위해 용도를 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 미토파지는 CCCP를 미토콘드리아 스트레스 유도제로 사용하고 염색12에 대한 옵티뉴린, LC3 및 LAMP2 항체를 사용하여 검사할 수 있습니다.

전반적으로, 자동화된 이미지 획득과 CellProfiler 분석의 조합은 단일 인간 섬유아세포의 고처리량 기능 평가를 위한 강력한 도구를 구성합니다. 이는 특히 인간 질병 연구와 관련이 있으며, 환자 유래 세포와 건강한 기증자 유래 세포의 대규모 코호트의 분석 및 비교가 큰 관심사입니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 독일 연구 재단(DFG)의 프로젝트 ID 259130777 SFB 1177(프로젝트 E03)의 지원을 받았습니다. 그림 1 은 BioRender를 사용하여 만든 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강>세포주
일차 피부 유래 인간 섬유아세포 피부 생검, 건강한 인간 기증자, Biobank University Clinic Tü bingen, 윤리적 승인 389/2019BO2F-CO-60, 통로 9
<강한>세포 배양 처리<강한>최종 농도(화합물)
대조 매체DMEM 10%FCS(DMSO만 해당)
대조군 배지 + bafilomycinA1DMEM 10%FCS100nM bafilomycin A1
대조군 배지 + deferasiox(DFX)DMEM 10%FCS30 & 마이크로; M DFX
제어 매체 + DFX + bafilomycinA1DMEM 10%FCS30 &마이크로; M DFX, 100 nM bafilomycin A1
제어 배지 + 구연산 암모늄 철 (FAC)DMEM 10 % FCS0.05 mg / mL FAC
제어 배지 + FAC + bafilomycinA1DMEM 10 % FCS0.05 mg / mL FAC, 100 nM bafilomycin A1
Material< / strong>
Albumin [BSA] Fraction VAppliChemA1391
Alexa 488 염소 토끼Life TechnologiesA-11008
Alexa 546 염소 마우스Life TechnologiesA-11003
Bafilomycin A1Sigma Aldrich196000
BioLite 세포 배양 처리 10cm 접시Thermo Scientific130182
DAPIAppliChemA4099
Deferasiox (ICL-670)SelleckchemS1712
DMEM 글루타맥스Gibco31966
DMSO AppliChemA3672
DPBS 칼슘이나 마그네슘 없음Gibco 14190094
소 태아 혈청 (FCS)Gibco10437-028
구연산 철 암모늄 (FAC)MerckF5879
Anti-FERRITIN (Human Spleen)Rockland200-401-090-0100
LAMP2 (H4B4)Santa CruzSc-18822
파라포름알데히드 (PFA)Sigma-Aldrich441244
PBS 10x Dulbecco' sAppliChemA0965
PenStrep (1,00U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스트렙토마이신)Life Technologies15140-122
Trypsin-EDTA (0.05%) with phenol redGibco25300
Tween20AppliChemA4974
96 well glass-bottom #0 platesCellvisP96-0-N
Solution
3.7% 파라포름알데히드 (PFA)PFA는 PBS에 용해, pH 7.5 
Bafilomycin A1 100 mM 주식Bafilomycin A1은 DMSO
Ferric ammonium citrate (FAC)에 희석되었습니다. 100 mg/mL 주식FAC는 고압 멸균 이중 증류수
PBS/T, 10% Tween20으로 보충되었습니다.
PBS/T + BSAPBS, 10% Tween20, 1% BSA로 보충됨;
Software
CellProfiler 4.2.4https://cellprofiler.org/
GraphPad PrismDotmatics
Microsoft Excel 버전 16.50Microsoft Office Plus 365
PBS에 희석되었으며

참고문헌

  1. Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome. Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).
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Ferritinophagy: 인간 섬유아세포에서 자가포식에 의한 철의 선택적 분해 평가
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