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방법 논문

방향족 아미노산에 의해 조절되는 세포 대사의 생체 직교 화학 이미징

1.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/65121

⸱

2023년 5월 12일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 이광자 여기 형광 현미경(2PEF)과 통합된 산화중수소(중수D2O) 탐침 자극 라만 산란(DO-SRS) 현미경을 사용하여 아미노산에 의해 조절되는 세포에서 대사 활동을 직접 시각화하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

필수 방향족 아미노산(AAA)은 세포에서 새로운 바이오매스를 합성하고 정상적인 생물학적 기능을 유지하기 위한 빌딩 블록입니다. 예를 들어, AAA의 풍부한 공급은 암세포가 빠른 성장과 분열을 유지하는 데 중요합니다. 이를 통해 세포가 현장에서 대사를 위해 AAA를 활용하는 방법을 직접 시각화하기 위해 최소한의 샘플 준비로 매우 특이적이고 비침습적인 이미징 접근 방식에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 여기에서 우리는 산화중수소(D2O) 프로빙과 유도 라만 산란(DO-SRS)을 결합하고 DO-SRS와 이광자 여기 형광(2PEF)을 단일 현미경에 통합하여 AAA 조절 하에 HeLa 세포의 대사 활동을 직접 시각화하는 광학 이미징 플랫폼을 개발합니다. 종합적으로, DO-SRS 플랫폼은 단일 HeLa 세포 단위에서 새로 합성된 단백질과 지질의 높은 공간 분해능과 특이성을 제공합니다. 또한, 2PEF 양식은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH) 및 플라빈의 자가형광 신호를 무표지 방식으로 검출할 수 있습니다. 여기에 설명된 이미징 시스템은 시험관 내 및 생체 내 모델 모두와 호환되며, 이는 다양한 실험에 유연합니다. 이 프로토콜의 일반적인 워크플로에는 세포 배양, 배양 배지 준비, 세포 동기화, 세포 고정, DO-SRS 및 2PEF 양식을 사용한 샘플 이미징이 포함됩니다.

서론

필수 방향족 아미노산인 페닐알라닌(Phe)과 트립토판(Tryp)은 인체에 흡수되어 정상적인 생물학적 기능을 유지하기 위한 새로운 분자를 합성할 수 있습니다1. Phe는 단백질, 멜라닌 및 티로신의 합성에 필요하고 Tryp은 멜라토닌, 세로토닌 및 니아신 2,3의 합성에 필요합니다. 그러나 이러한 AAA의 과도한 섭취는 포유류의 라파마이신(mTOR) 경로 표적을 상향 조절하고, AMP 활성화 단백질 키나아제를 억제하며, 미토콘드리아 대사를 방해하여 거대분자 생합성을 집합적으로 변화시키고 건강한 세포에서 활성 산소종(ROS)과 같은 악성 전구체의 생성을 유도할 수 있습니다 4,5,6. 과도한 AAA 조절 하에서 변화된 대사 역학의 직접적인 시각화는 암 발병과 건강한 세포의 성장을 촉진하는 AAA의 역할을 이해하는 데 필수적입니다 7,8,9.

전통적인 AAA 연구는 가스 크로마토그래피(GC)에 의존합니다10. 자기공명영상(MRI)과 같은 다른 방법들은 제한된 공간 분해능을 가지며, 이는 생물학적 샘플의 세포 및 준세포 분석을 수행하기 어렵게 만든다11. 최근에, 비침습적 바이오마커12,13,14를 사용하여 암 증식에서 지질 및 단백질 합성에서 AAA의 역할을 설명하기 위해 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI)가 개발되었습니다. 그러나 이 기술은 여전히 얕은 이미징 깊이, 열악한 공간 해상도 및 광범위한 샘플 준비로 어려움을 겪고 있습니다. 세포 수준에서 질소-15 및 탄소-13과 같은 무독성 안정 동위원소는 다중 동위원소 이미징 및 나노 스케일 2차 이온 질량 분석법으로 추적하여 거대분자로의 결합을 이해할 수 있습니다. 그러나, 이들 방법은 살아있는 생물학적 샘플(15,16)을 파괴한다. 원자력 현미경(Atomic force microscopy, AFM)은 대사 역학을 시각화할 수 있는 또 다른 강력한 기술이다17. 반면에 AFM 이미징 중 스캔 속도가 느리면 열 드리프트로 인한 이미지 왜곡이 발생할 수 있습니다.

우리는 중수소-산화물(D2O) 프로브 자극 라만 산란(DO-SRS) 현미경 및 무표지 이광자 여기 형광 현미경(2PEF)을 결합하여 비침습적 쌍직교 이미징 방식을 개발했습니다. 이 양식은 생물학적 샘플 18,19,20,21,22,23,24를 이미징 할 때 높은 공간 분해능 및 화학적 특이성을 달성합니다. 이 프로토콜은 암 진행 중 지질, 단백질 및 산화 환원 비율 변화의 대사 역학을 조사하기 위해 DO-SRS 및 2PEF의 응용 프로그램을 소개합니다. D2O가 안정한 동위원소 형태의 물이기 때문에, 세포 내 총 체수분으로 빠르게 보상되어 효소 교환을 통해 탄소-중수소(C-D) 결합을 형성하기 때문에 세포 생체 분자를 중수소(D)로 표지할 수 있습니다21. 지질, 단백질, DNA/RNA 및 탄수화물을 포함하여 새로 합성된 거대분자의 C-D 결합은 라만 스펙트럼20,21,22,25,26,27의 세포 침묵 영역에서 검출될 수 있습니다. 두 개의 동기화된 레이저 펄스를 사용하면 새로 합성된 지질과 단백질의 C-D 결합을 추출하거나 세포독성제로 표지하지 않고도 초분광 이미징(HSI)을 통해 단일 세포에 표시할 수 있습니다. 또한, SRS 현미경은 일련의 단면 이미지(22,26)를 캡처하고 조합함으로써 생물학적 샘플에서 선택된 관심 영역의 3차원(3D) 모델을 구성할 수 있는 능력을 갖는다. 초분광 및 3D 체적 이미징을 통해 DO-SRS는 AAA 규정22에 따라 암 성장을 촉진하는 과정을 촉진하는 세포 기관 유형과 함께 단일 세포에서 새로 합성된 거대분자의 공간 분포를 얻을 수 있습니다. 또한, 2PEF를 사용하여, 우리는 생물학적 샘플21,23,24에서 고해상도, 깊은 침투 깊이 및 낮은 수준의 손상을 갖는 플라빈 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)의 자가형광 신호를 얻을 수 있습니다. Flavin 및 NADH 자가형광 신호는 암세포에서 산화환원 항상성 및 지질 과산화를 특성화하는 데 사용되었습니다22,26. 따라서 DO-SRS와 2PEF의 결합은 높은 공간 분포, 화학적 특이성 정보 및 최소한의 샘플 준비로 암세포에서 AAA 조절 대사 역학의 세포 내 분석을 제공할 뿐만 아니라 이 방법은 독성 시약으로 내인성 분자를 추출하거나 라벨링할 필요성을 줄여줍니다. 이 프로토콜에서 우리는 먼저 D2O 및 아미노산 준비뿐만 아니라 암 세포 배양의 절차를 제시합니다. 그런 다음 DO-SRS 이미징 및 2PEF 이미징의 프로토콜을 보여줍니다. 마지막으로 지질과 단백질의 AAA 조절 대사 변화와 암세포의 산화환원 비율 변화를 보여주는 SRS 및 2PEF 이미징의 대표적인 결과를 제시합니다. 프로세스에 대한 자세한 그림은 그림 1에 강조 표시되어 있습니다.

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프로토콜

1. 매체 준비

  1. 50%D2O를 함유하는 Dulbecco's modified Eagle 배지(DMEM)에서 10mL의 대조군 및 과잉 AAA를 준비합니다.
    1. 대조군 배지의 경우, 15 mL 코니컬 튜브에서 10 mg의 DMEM 분말과 4.7 mL의 이중 증류수(ddH2O)를 측정하고 혼합한다. DMEM 분말은 표준 농도의 모든 아미노산을 함유하고 있습니다. 용액이 잘 섞이도록 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다. 4.7mL의 D2O, 0.5mL의 소 태아 혈청(5% FBS), 0.1mL의 페니실린/스트렙토마이신(1%)을 추가합니다. 용액이 잘 섞이도록 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다.
    2. 15x Phe 처리 배지의 경우 15mL 원뿔형 튜브에서 10mg의 DMEM 분말과 4.7mL의 ddH2O, 0.5mL의 FBS(5%) 및 0.1mL의 페니실린/스트렙토마이신(1%)을 측정하고 혼합합니다. 용액이 잘 섞이도록 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다. 924mg/L 농도의 과잉 Phe 분말을 배지에 첨가합니다. 용액이 잘 섞이도록 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다.
    3. 15x Tryp 처리 배지의 경우 15mL 원뿔형 튜브에서 10mg의 DMEM 분말과 4.7mL의 ddH2O, 0.5mL의 FBS(5%) 및 0.1mL의 페니실린/스트렙토마이신(1%)을 측정하고 혼합합니다. 용액이 잘 섞이도록 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다. 224 mg/L의 농도에 과잉 Tryp 분말을 매체에 추가하십시오. 용액이 잘 섞이도록 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다.
    4. 메티오닌과 트레오닌을 각각 30.0 mg/mL 및 95.0 mg/mL로 이전 단계의 모든 원추형 튜브에 추가합니다. 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다. 피루브산 나트륨은 배양 배지에 첨가 할 필요가 없습니다.
    5. 0.22μm 폴리에테르설폰 멤브레인 필터가 있는 25mm 실린지 필터로 제어 및 처리 매체를 필터링합니다.
    6. 배지가 포함된 모든 원뿔형 튜브를 파라필름으로 밀봉하고 4°C에서 최대 3주 동안 보관합니다. 세포를 배지로 처리하기 전에 모든 배지를 37°C로 따뜻하게 합니다.
      참고: 분말 및 액체 시약은 처리 및 대조 배지의 총 부피를 기준으로 측정 및 결합해야 합니다.

2. 세포 시료 준비

  1. 37°C 및 5% 이산화탄소(CO2)에서 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 표준 DMEM을 사용하여 배양 플라스크(즉, T10, T25 등)에서 자궁경부암(HeLa) 세포를 유지합니다.
  2. HeLa 세포를 80% 이상의 세포 생존율에 도달할 때까지 1:10의 분할 비율로 계대 배양합니다.
  3. 세포가 80% 이상의 밀도에 도달하면 0.5% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM을 사용하여 웰당 2 x 105 개의 세포를 24웰 플레이트에 시딩합니다.
    1. 세포 파종 전에 멸균된 폴리-d-라이신, 라미닌 코팅, 직경 12mm의 원형 커버슬립이 있는 24웰 플레이트를 준비합니다. 커버슬립을 70% 에탄올에 담그고 보푸라기가 없는 물티슈로 부드럽게 말립니다. 깨끗한 커버슬립을 플레이트의 적절한 웰에 놓습니다.
    2. 2.2단계에서 세포가 80% 밀도에 도달하면 마그네슘 및 칼슘 이온 없이 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 한 번 세척합니다.
    3. 0.25% 트립신을 첨가하여 부착 세포를 플라스크로부터 해리시키고 37°C 및 5%CO2 에서 3분 동안 배양한다.
    4. 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM을 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅한 다음 실온(RT)에서 300 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다.
    5. 0.5% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 세포를 재현탁합니다.
    6. 혈구계, 광학 현미경 및 트리판 블루를 사용하여 세포를 계수하고, 24-웰 플레이트의 웰 당 2 x 105 세포의 밀도를 시딩하였다. 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수할 수 있습니다.
    7. 세포를 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터로 되돌리고, 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포가 고르게 분포되도록 한다.
  4. 8시간 후, 기존 배양 배지를 50% D2O/초과 Phe 또는 50%D2O/초과Tryp 배지로 교체합니다. 세포를 37°C 및 5%CO2에서 36시간 동안 인큐베이터로 되돌린다.
  5. 36시간 후, 현미경 슬라이드에 세포를 고정한다.
    1. 고정하기 전에 직경 9mm의 이미징 스페이서가 있는 현미경 슬라이드를 준비하고 칼슘과 마그네슘 이온이 보충된 1x PBS 15μL를 배치합니다.
    2. 칼슘과 마그네슘 이온이 보충된 1x PBS로 세포를 헹굽니다.
    3. 0.5mL의 4% 메탄올이 없는 파라포름알데히드(PFA) 용액을 추가하고 플레이트를 약 15분 동안 생물안전 후드 아래에 둡니다.
    4. PFA 용액을 흡인하고 칼슘과 마그네슘 이온이 보충된 1x PBS로 두 번 헹굽니다.
    5. 칼슘과 마그네슘 이온이 보충된 1x PBS 1.5mL를 각 웰에 추가합니다.
    6. 멸균 핀셋을 사용하여 각 우물에서 커버 슬립을 부드럽게 잡습니다. 커버슬립의 세포 함유 면을 뒤집어 이미징 스페이서 위에 놓고 2.5.1단계에서 준비된 PBS와 접촉시킵니다. 비 세포 함유 측이 공기에 노출되었는지 확인하십시오.
    7. 투명 매니큐어를 사용하여 커버슬립의 바깥층을 이미징 스페이서로 밀봉합니다.
  6. 이미징을 하지 않을 때는 현미경 슬라이드를 4°C에서 보관하십시오.

3. 자발적 라만 분광법 측정(그림 2)

  1. 컨포칼 라만 현미경을 사용하여 자발적인 라만 스펙트럼을 얻을 수 있습니다(그림 2A).
  2. 키를 ON 위치로 돌려 레이저를 켭니다.
  3. LabSpec6 소프트웨어 아이콘을 더블 클릭하여 수집 소프트웨어를 엽니다.
  4. 생물학적 샘플을 대물 렌즈 바로 아래에 있는 샘플 홀더에 로드합니다.
  5. 소프트웨어에서 카메라 아이콘을 클릭하여 비디오 카메라를 켭니다.
  6. 초점 평면을 조정하여 50x 대물 렌즈로 관심 영역을 식별합니다. 조이스틱을 움직여 XY s의 평면 이동을 제어합니다.tage 조이스틱을 돌려 초점 심도를 변경합니다.
  7. 측정 위치를 선택한 후 40mW의 여기 파워를 가진 100x 대물 렌즈로 전환합니다. 빨간색 중지 아이콘을 클릭하여 비디오 카메라를 끕니다.
  8. 1800 lines/mm의 격자를 선택하고 획득 범위를 400cm-1에서 3,150cm-1로 설정합니다.
  9. Acquisition Time을 90초로, Accumulation을 3으로, Binning을 4로 설정하여 노이즈를 최소화하고 스펙트럼을 가장 정확하게 측정합니다.
    참고: 이러한 이미징 매개변수는 실험에 맞게 최적화할 수 있습니다.
  10. 화살표 아이콘을 클릭하여 실시간 디스플레이를 켭니다.
  11. 라만 시프트(cm-1)를 선택한 값으로 조정하여 초점 평면을 미세 조정합니다.
    참고: 이 실험에서 라만 레이저는 고농도의CH2 결합을 포함하는 지질 방울에 초점을 맞췄습니다. 따라서,CH2 결합의 연신 모드와 일치하는 2,850 cm-1의 라만 시프트가 목적을 위해 선택되었다.
  12. 조이스틱으로 초점면을 조정하여 최상의 신호 대 잡음비를 최적화합니다.
  13. 초점 평면을 선택한 후 빨간색 중지 아이콘을 클릭하면 실시간 디스플레이가 표시됩니다.
  14. Circle 아이콘을 선택하여 스펙트럼 수집을 시작합니다.
  15. 세포 영역을 촬영한 후에는 동일한 초점 평면을 사용하여 PBS로 배경을 측정합니다. Origin과 같은 별도의 컴퓨터 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 각 세포 내 타겟 스펙트럼에서 배경 스펙트럼을 뺍니다(그림 1B).

4. 2PEF 및 SRS를 사용한 이미징 실험

참고: SRS 레이저 정렬에 대한 자세한 설명은 이전 보고서28에서 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜은 다중 모드 SRS 및 2PEF 이미징 시스템의 작동에 중점을 둡니다(그림 2C, D).

  1. 시작을 클릭하여 레이저를 예열합니다.
  2. 1) 컨트롤 박스 IX3-CBH의 메인 스위치를 On으로 누르고, 2) 터치 패널 컨트롤러의 메인 스위치를 On으로 누르고, 3) 메인 레이저 결합기 FV31-SCOMB에 연결된 LD OBIS 6 Laser Remote용 전원 공급 장치의 AC 어댑터 메인 스위치를 On으로 누릅니다., 4) 서브 레이저 결합기 FV31-SCOMB에 연결된 LD OBIS 6 Laser Remote용 전원 공급 장치의 AC 어댑터 메인 스위치를 On으로 누릅니다.
  3. Si 포토다이오드 검출기와 락인(lock-in)의 메인 스위치를 누릅니다.
  4. 스톡스 빔을 1,031nm, 펄스 폭을 6ps, 반복률을 80MHz로 설정합니다.
  5. 현미경에 결합하여 720-990nm의 조정 가능한 파장 , 5-6ps의 펄스 폭 및 80MHz의 반복률 로 동기화된 펌프 빔과 함께 제공되는 picoEmerald 시스템을 설정합니다. 펌프와 Stokes의 평균 여기 전력은 450mW입니다. 여기 파워를 최적화하여 시료의 광손상을 최소화합니다.
  6. 높은 개구수(NA) 오일 콘덴서(즉, 1.4NA)를 사용하여 스톡스를 수집하고 콘덴서에 몇 방울을 떨어뜨려 샘플이 장착된 빔을 펌핑합니다.
  7. 오일에 샘플을 장착하고 샘플이 고정된 현미경 슬라이드 위에 큰 물방울을 놓습니다. 이것은 침수 대물 렌즈용입니다.
  8. 락인앰플리파이어를 20MHz로 설정합니다. 이제 초고해상도 소프트웨어 모듈을 사용하여 이미지를 처리합니다.
  9. 체류 시간으로 512 픽셀 x 512 픽셀 및 80 μs/픽셀을 선택합니다.
  10. 원하는 세포 영역에 초점이 맞춰지면 이미지를 획득합니다. 현미경의 수집 소프트웨어를 사용하여 이미지를 Olympus .oir 그래픽 파일로 저장합니다.
  11. 1,900cm-1에서 배경 이미지를 획득하고 모든 셀룰러 이미지에서 뺍니다.
  12. 2PEF 이미징을 수행하려면 동일한 조정 가능한 피코초 레이저를 사용하고 Flavin 및 NADH의 무표지 자가형광을 각각 800nm 및 780nm로 설정합니다.
  13. 460nm/515nm 필터 큐브를 사용하여 Flavin 및 NADH 자가형광 후방 산란 방출을 수집합니다.
  14. 체류 시간을 8μs/픽셀로 조정하고 픽셀 크기를 512픽셀 x 512픽셀로 조정합니다. 레이저 셔터 출력 매개변수를 150mW로 설정합니다.
  15. 3D 이미지 재구성을 위해 자극된 라만 손실을 2,850cm-1(797nm)로 조정합니다.
  16. 원하는 단일 세포가 식별되면 레이저를 등록하여 상단 초점 평면에서 스캔하여 해당 셀의 상단 및 하단 레이어를 감지합니다.
    참고: 3D 모델이 생성되어 .oir 파일로 저장됩니다.

5. 스펙트럼 및 이미지 분석

  1. 스펙트럼 분석
    1. Origin 소프트웨어 또는 기타 관련 응용 프로그램을 사용하여 모든 세포 내 표적 스펙트럼에서 배경 스펙트럼을 뺍니다.
    2. MATLAB의 수학적 모델링 연산을 사용하여 소프트웨어에 내장된 함수로 라만 스펙트럼을 처리할 수 있습니다. Python은 스펙트럼 처리에도 사용할 수 있습니다.
      1. 스펙트럼 전처리는 파일을 배열로 변환하는 것으로 시작됩니다. 스펙트럼은 매 역수 센티미터에서 보간됩니다.
      2. 검증을 위해 원시 데이터를 그래프로 표시합니다. MATLAB에 내장된 함수 msbackadj 를 사용하여 원시 스펙트럼에 대한 기준선 보정을 수행합니다. 간단히 말해서 기본 제공 함수는 사용자가 식별한 분리 단위 값에서 기준점을 추정하고 인접한 창 사이의 거리를 반환합니다. 기준선에서 회귀선을 추정하고 그립니다. Apply Smoothing(스무딩) 을 적용하여 회귀선을 평활화하여 각 개별 원시 스펙트럼에서 기준선을 뺍니다.
      3. 2,930cm-1에서 단백질의 라만 강도를 각 라만 시프트의 강도로 나누어 최소-최대 정규화를 수행합니다. 2,930cm-1 신호는 일반적으로 라만 스펙트럼에서 가장 높은 강도입니다. 이 정규화를 사용하면 최대값은 1로 변환되고 최소값은 0으로 변환됩니다. 다른 모든 값은 0과 1 사이의 10진수로 변환됩니다.
      4. 노이즈를 줄이기 위해 동일한 조건의 개별 스펙트럼을 단일 스펙트럼으로 평균화합니다.
    3. 처리가 완료되면 Origin과 같은 응용 프로그램을 사용하여 모든 스펙트럼을 동시에 표시합니다. 스펙트럼에 표시된 피크는 특정 화학 결합 또는 작용기를 나타냅니다.
  2. 지질 방울의 3D 이미지 분석
    1. FIJI-ImageJ 소프트웨어를 사용하여 모든 3D 이미지 처리
    2. 3D 이미지 스택에 대해 대역통과 필터 및 스무딩 기능을 수행합니다.
    3. 3D 이미지 분석의 경우 각 지질 방울을 질량 중심과 표면 사이의 거리를 측정하여 계산된 구형 점수에 할당합니다. 각 구형 점수를 동일한 유클리드 평면도에서 완벽한 구의 구형 점수와 비교합니다. 구형 점수가 낮은 지질 방울을 버리고 나머지 지질 방울의 부피와 개수를 평가합니다.
    4. 적절한 통계 소프트웨어 응용 프로그램에서 통계적 유의성을 위해 서로 다른 처리 사이의 지질 방울의 양과 개수를 분석합니다. 여기서는 GraphPad Prism을 사용했습니다.
  3. 2D 초분광 이미지 분석
    1. FIJI-ImageJ 소프트웨어를 사용하여 모든 2D 초분광 이미지를 처리할 수 있습니다.
    2. 2,930cm-1 채널을 선택하여 0과 1 값을 포함하는 마스크 이미지를 만듭니다. 배경을 0에 할당하고 셀룰러 영역을 1에 할당합니다.
    3. 중수소 표지 단백질 채널(2,175 cm-1)을 배경 채널(1,900 cm-1)에서 빼서 형광 효과를 제거합니다.
    4. 생성된 중수소 표지 단백질 채널을 단백질 채널(2,930cm-1)로 나누어 단백질 회전율 비율계량 이미지를 얻습니다.
    5. 그런 다음 5.3.2단계에서 만든 마스크 이미지에 비율계량 이미지를 곱하여 남아 있는 배경 소음을 제거합니다. 그 결과, 어두운 배경이 각 비율계량 이미지에 생성됩니다.
    6. FIJI-ImageJ의 자유형 선택 도구를 사용하여 단일 셀에 표시되는 픽셀 강도를 수동으로 분할하고 계산할 수 있습니다. 픽셀 강도는 시각화되는 화학 결합의 농도에 해당합니다.
    7. 적절한 통계 소프트웨어 응용 프로그램에서 통계적 유의성을 위해 픽셀 강도를 분석합니다. 여기서는 GraphPad Prism을 사용했습니다. 나머지 비율계량 분석과 함께 이 분석을 반복합니다.

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결과

50%D2O-함유 세포 배양 배지에 15x 농도의 과량의 AAA를 첨가하면 HeLa 세포에서 새로 합성된 지질 및 단백질의 뚜렷한 C-D 라만 밴드가 생성되었습니다(그림 2B). 이전 실험은 2x 및 5x와 같은 다양한 농도 수준으로 수행되었으며 데이터가 제시되지는 않았지만 15x 농도는 새로 합성된 지질 및 단백질의 가장 뚜렷한 C-D 라만 밴드를 생성했습니다. 구체적으로, 지질 방울(LD)을 조사함으로써 15x Phe와 15x Tryp 모두 각각 2,143cm-1 및 2,172cm-1에서 새로 합성된 지질과 단백질 신호를 유도한다는 것을 발견했습니다. DO-SRS는 이후 단일 셀에서 C-D 신호의 공간 분포를 시각화하는 데 사용되었습니다(그림 3). ImageJ를 사용하여 그림 3A에서 흰색 점선 테두리로 표...

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토론

DO-SRS 및 2PEF 이미징은 초파리 및 인간 조직 21,22,23,24,26,27,33을 포함한 다양한 생체 외 모델에서 대사 역학을 조사하기 위해 적용되었습니다. 이 연구에 사용된 이미징 양식은 DO-SRS 및 2PEF 현미경을 통합하여 분자 추출 또는 세포독성 시약으로 라벨링할 필요가 없고 최소한의 샘플 준비가 필요하므로 다른 분자별 이미징 방법을 능가할 수 있습니다. 특히, DO-SRS 현미경을 통해 동물과 세포에서 새로운 지방 생성 및 단백질 합성을 조사하고 현장에서 대사 ...

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공개 사항

저자는 경쟁적인 재정적 이해 관계나 기타 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

기술 지원을 해주신 Yajuan Li 박사와 Anthony Fung, 세포주에 대해 Fraley 연구실에 감사드립니다. 우리는 UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 및 Hellman Fellow Award의 창업 자금을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10 mL 혈청학적 피펫 Avantor(VWR 기준)75816-100https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100
15 mL 원추형 원심분리기 튜브VWR89039-664
https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 16% 포름알데히드, 메탄올 무함유ThermoFisher Scientific28906https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906
24웰 플레이트FisherbrandFB0112929https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929
25 mm 주사기 필터, 2 μ m PESFoxx Life Sciences381-2216-OEMhttps://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003
460 nm 필터 큐브OlympusOCT-ET460/50M32
LD OBIS 6 레이저 원격전원 공급레이저
대역 통과 필터KR ElectronicsKR27248MHz
BNC 50 옴 터미네이터 미니 회로STRM-50
BNC 케이블Thorlabs2249-C동축 케이블, BNC 수/수
광대역 유전체 미러ThorlabsBB1-E03750 - 1100 nm
원심분리기
콘덴서올림푸스
커버 유리코닝2850-25https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25
DC 전원 공급 장치TopWard6302D
Dichroic MountThorlabsKM100CL
Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagentmpbio 196055
https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf 둘베코의 변형된 독수리' 메티오닌, 트레오닌 및 피루브산 나트륨이 없는 배지MilliporeSigma38210000https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder
소듐 바이카보네이트와 메티오닌, 트레오닌, 그리고 소듐 피루베이트가 없는 경우 
둘베코' 의 변형된 독수리' s MediumCorningMT10027CVhttps://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20
FIJI ImageJImageJ버전 1.53t 2022년 8월 24https://imagej.net/software/fiji/downloads
중수(중수소산화물)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.7732-18-5https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L
Hela CellsATCCCCL-2https://www.atcc.org/products/ccl-2
혈구계MilliporeSigmaZ359629-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI
zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk
QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr
SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL
w_wcB& gclsrc=aw.ds
High O.D. Bandpass FilterChroma TechnologyET890/220mStokes 빔을 필터링하고 펌프 빔을 전송합니다.
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)Cytiva SH300880340
https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 HyClone Trypsin 0.25% (1x) SolutionCytivaSH30042.02 https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445
Integrated SRS Laser SystemApplied Physics & 전자, Inc.picoEMERALDpicoEMERALD는 1031nm에서 6ps 펄스 폭과 80MHz 반복률로 출력 펄스를 제공하며, 이는 스톡스 빔 역할을 합니다. 532nm에서 주파수 이중 빔은 피코초 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 동기식으로 시드하여 5~6ps 펄스 폭의 모드 잠금 펄스 트레인을 생성하는 데 사용됩니다(OPO의 아이들러 빔은 간섭계 필터로 차단됨). OPO의 출력 파장은 720&ndash에서 조정할 수 있습니다. 950nm, 펌프 빔 역할을 합니다. 1031nm Stokes 빔의 강도는 90% 이상의 변조 깊이로 8MHz에서 내장 EOM에 의해 사인파로 변조됩니다. 펌프 빔은 picoEMERALD 내부의 이색성 거울을 사용하여 Stokes 빔과 공간적으로 겹칩니다. 펌프와 스톡스 펄스 사이의 시간적 겹침은 내장된 지연 스테이지를 통해 달성되며 현미경에서 순수 D2O의 SRS 신호에 의해 최적화됩니다.
도립 레이저 스캐닝 현미경올림푸스FV1200MPE
IX3-CBH 컨트롤 박스올림푸스레이저 스캐닝 현미경
제어 키네마틱 미러 마운트ThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 로우 프로파일 육각 조절기
L-페날린시그마P5482-25Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482
L-트립토판시그마T8941-25G
https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 LabSpec 6Horiba XploRAN/Ahttps://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/
락인 앰프취리히 인스트루N/Ahttps://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier
장역 통과 이색성 빔 스플리터SemrockDi02-R980-25x36980nm 레이저 BrightLine 단일 에지 레이저 평면 이색성 빔 스플리터
MATLABMathWorks버전: R2022bhttps://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html
현미경 슬라이드Fisherbrand12-550-003https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003
현미경 이미징 소프트웨어OlympusFluoView
MPLN 100x, OlympusOlympusMPLAPONhttps://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364
MPLN 50x, OlympusOlympusMPLAPON https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[초점]=cmsContent11363
NA 오일 콘덴서Olympus 6-U130https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser
매니큐어웻 앤 와일드B01EO2G5O4https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW
HHQP38FXXDC_0
OriginOriginLabOrigin 2022b (9.95)https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin
ParafilmFisher ScientificS37440https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782
PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)Thermofischer - Gibco14040117https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117
페니실린/스트렙토마이신테르모피셔 - Gibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
잠망경 어셈블리ThorlabsRS99상단 및 하단 유닛 포함, Ø 1" 포스트 및 클램핑 포크.
picoEmerald 시스템A.P.EN/A
https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ 차폐 상자(BNC 커넥터 포함Pomona Electronics2902알루미늄 상자(커버 포함), BNC 암/암
Si 포토다이오드 검출기홈 빌트인N/ADYI 시리즈
실리콘 웨이퍼
스페이서Grace Bio-Labs654008https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/
자발적 라만 분광법Horiba XploRAN/Ahttps://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/
자극 라만 산란 현미경집에 내장N/A
Touch  패널 컨트롤러올림푸스레이저 스캐닝 현미경의 X-Y 방향 제어
Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) 론자17-942Ehttps://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"
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두 개의 광자 여기 형광 현미경 집에서만든N/A
계량 종이 VWR12578-165https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper
취리히 LabOneQ 소프트웨어취리히 기기는취리히 락인앰플리터를 제어합니다.
장치의 AC 어댑터 에 전원 공급 일 먼트 )

참고문헌

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