우리는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)를 분리하고 배양하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 또한 hSVEC의 기계적 응력을 연구하기 위해 전단 응력과 스트레치를 생성하는 자세한 방법을 제공합니다.
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방법 논문
인간 복재 정맥 내피 세포 분리 및 제어된 수준의 전단 응력 및 스트레칭에 대한 노출
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
관상동맥우회술(CABG) 수술은 허혈성 심근을 혈관재생시키는 절차입니다. 복재 정맥은 동맥 도관에 비해 감소된 장기 개통성에도 불구하고 CABG 도관으로 계속 사용됩니다. 이식편 동맥화와 관련된 혈역학적 스트레스의 급격한 증가는 복재 정맥 이식편(SVG)의 낮은 개통성에 영향을 미칠 수 있는 혈관 손상, 특히 내피를 초래합니다. 여기에서 우리는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)의 분리, 특성화 및 확장에 대해 설명합니다. 콜라게나제 분해에 의해 분리된 세포는 전형적인 조약돌 형태를 나타내고 내피 세포 마커인 CD31 및 VE-cadherin을 발현합니다. 기계적 응력 영향을 평가하기 위해 이 연구에서 동맥화된 SVG에 대한 두 가지 주요 물리적 자극인 전단 응력과 스트레치를 조사하기 위해 프로토콜을 사용했습니다. hSVEC는 평행판 유동 챔버에서 배양되어 전단 응력을 생성하여 유동 방향으로의 정렬과 KLF2, KLF4 및 NOS3의 발현 증가를 보여줍니다. hSVEC는 또한 정맥(저) 및 동맥(고) 스트레칭을 모방하여 제어된 세포 스트레치를 허용하는 실리콘 멤브레인에서 배양될 수 있습니다. 내피 세포의 F-액틴 패턴과 산화질소(NO) 분비는 동맥 스트레칭에 의해 그에 따라 조절됩니다. 요약하면, 우리는 내피 표현형에 대한 혈역학적 기계적 스트레스의 영향을 연구하기 위해 hSVEC를 분리하는 자세한 방법을 제시합니다.
서론
내피 세포 (EC) 기능 장애는 복재 정맥 이식 실패 1,2,3,4에서 핵심적인 역할을 한다. 전단 응력과 주기적 스트레칭의 지속적인 증가는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)의 전염증 표현형을 유도합니다3,4,5,6. 기본 분자 경로는 아직 완전히 이해되지 않았으며 시험관 내 연구를 위한 표준화된 프로토콜은 해당 분야의 새로운 통찰력을 위한 노력을 활용할 수 있습니다. 여기에서는 hSVEC를 분리, 특성화 및 확장하는 간단한 프로토콜과 정맥 및 동맥 혈역학적 조건을 모방하여 다양한 수준의 전단 응력 및 주기적 스트레치에 hSVEC를 노출시키는 방법을 설명합니다.
hSVEC는 콜라게나제 배양에 의해 분리되며 계대 8까지 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이용가능한 다른....
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프로토콜
상파울루 의과대학 심장연구소(InCor)에서 대동맥관상동맥우회술을 받은 환자로부터 복재정맥의 미사용 부분을 채취하였다. 모든 개인은 지역 윤리 위원회에서 검토하고 승인한 연구 참여에 대해 정보에 입각한 동의를 했습니다.
1. 일차 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)의 분리, 배양 및 특성화
- 준비
- 한 쌍의 직선 또는 곡선 집게와 조직 가위 (7-8cm)를 오토 클레이브하십시오.
- 멸균 젤라틴을 준비하십시오. 돼지 껍질 젤라틴 0.1g(0.1% w/v) 또는 3g(3% w/v)을 초순수 100mL와 혼합하고 15분 동안 오토클레이브한 후 4°C에서 보관합니다. 세포 배양 접시 및 슬라이드를 코팅하기 전에 37°C로 가온하여 액화시킨다.
- 층류 후드 내부에 멸균 콜라게나제(1mg/mL)를 준비합니다. 콜라게나아제를 PBS에 희석하고 0.2μm 필터로 멸균한다.
- 60mm 세포 배양 접시와 8웰 챔버 슬라이드를 0.1% w/v 젤라틴으로 37°C에서 최소 30분 동안 코팅합니다. 세포를 파종하기 전에 과도한 젤라틴을 제거하십시오.
- 완전한 내피 세포 배지 준비: EGM2 성장 인자로 보충된 내피 세포 성장 기본 ....
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결과
일반적으로 부착된 EC는 추출 후 3-4일 후에 관찰할 수 있습니다. hSVEC는 초기에 세포 클러스터를 형성하고 전형적인 "조약돌" 형태를 나타냅니다(그림 1B). 이들은 EC 마커 CD31(그림 1C,D) 및 VE-카데린(그림 1D)을 발현합니다. hSVEC는 코팅되지 않은 처리된 세포 배양 접시에서 쉽게 증식할 수 있으며 최대 8계대 배양에서 내피 표현형을 유지합니다.
hSVEC는 전단 응력 하에서 배양될 때 유동 방향으로 정렬됩니다(그림 2A). 72시간 동안 20dyn/cm2의 전단 응력은 전형적인 기계 민감성 유전자인 KLF2, KLF4 및 NOS3의 발현을 유도하여 hSVEC에서 전단 자극의 효과를 나타냅니다(
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토론
복재 정맥 분절은 hSVEC를 성공적으로 분리하기 위해 최소 2cm가 되어야 합니다. 작은 세그먼트는 다루기가 어렵고 세포를 분리하기 위해 콜라게나제 용액을 유지하기 위해 혈관의 끝을 묶습니다. 감소된 내강 표면적은 배양을 확장하기에 충분한 세포를 생성하지 않습니다. 비 EC로 인한 오염 위험을 최소화하려면 복재 정맥 부분의 조작이 전체 절차 동안 매우 부드럽게해야합니다. 혈액을 제거하기 위해 피펫 팁을 내강 표면에 도입 할 때와 콜라게나제 용액을 도입 할 때는주의해야합니다. 효소 용액에 대한 노출은 비 EC에 의한 배양의 오염을 줄이기 위해 매우 잘 제어되어야 합니다(1시간 이내). 성장 인자 칵테일이 보충된 특정 EC 배지의 사용은 hSVEC 배양 성장에 매우 중요합니다. 배양 첫날 동안 헤파린을 추가로 섭취하면 정맥 분절에서 적혈구가 잔류하는 것을 줄이고 평활근 세포 증식을 억제하는 데 중요하다15. 실험을 위해 또는 배양을 유지하기 위해 세포를 통과시킬 때 40% 이상의 합류점으.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
JEK는 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 및 2013/17368-0] 및 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 및 309179/2013-0)의 보조금으로 지원됩니다. AAM은 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo(FAPESP 2015/11139-5) 및 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq(Universal - 407911/2021-9)의 보조금으로 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신-0.02% EDTA 용액 | Gibco | 25200072 | |
| 15 &마이크로; 슬라이드 I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-웰 등축방향 로딩 스테이션 25 mm | 플렉셀 인터내셔널 코퍼레이션 | LS-3000B25. VJW | |
| 8웰 챔버 슬라이드, 탈착식 웰 | 포함 Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| 아크릴 시트 1cm 두께 | 의 플렉시글라스 | ||
| Anti-CD31 항체 | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC 항체 | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin 항체 | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| 소 혈청 알부민 용액 | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom 설계된 | |
| 사이클로필린 리버스 프라이머 | Thermo Fisher Scientific | 맞춤형 설계 | |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 기초 매체 | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots 보충제 | Lonza | CC4176 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 장력 시스템 | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| 플루오로마운트 수성 장착 매체 | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| 돼지 껍질의 젤라 | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| 글리세롤 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| 염소 안티 마우스 IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| 염소 항 토끼 IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| 돼지 장 점막의 헤파린 나트륨 5000 IU/mL | Blau Farmacê utica | SKU 68027 | |
| Ibidi 펌프 시스템(펌프 + 유체 장치) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 포워드 프라이머 | Thermo Fisher Scientific | 맞춤형 KLF2 | |
| 리버스 프라이머 | Thermo Fisher Scientific | 맞춤형 KLF4 | |
| 포워드 프라이머 | Thermo Fisher Scientific | 맞춤형 KLF4 | |
| 리버스 프라이머 | Thermo Fisher Scientific | 맞춤형 NOA | |
| 280 산화질소 분석기 | 시버 기기 | NOA-280i-1 | |
| NOS3 포워드 프라이머 | Thermo Fisher Scientific | 맞춤형 | |
| NOS3 리버스 프라이머 | Thermo Fisher Scientific | 맞춤형 | |
| 파라포름알데히드(PFA) | 시그마-알드리치 | 158127 | |
| 관류 세트 15cm, ID 1.6mm, 빨간색, 10mL 리저브 | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| 요오드화 | 칼륨Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR 녹색 PCR 키트 | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K 플렉스 플랫폼 | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy 마이크로 키트 | Quiagen | 74004 | |
| 슬라이드 유리(24mm x 60mm) | 니트 유리 | VD12460Y1D.01 | |
| 아질산나트륨 | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV 1차 가닥 합성 시스템 | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
참고문헌
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechani....
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