방법 논문

달걀 노른자 항체를 기반으로 한 세포 측정 비드 분석의 표준화

DOI:

10.3791/65123

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2023년 5월 19일

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1Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas - UFAM, 2Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia – Universidade Estadual do Amazonas/Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, 5Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 항원 검출을 위해 IgY 항체를 사용하여 분석용 라텍스 비드를 제조하는 방법론을 설명합니다.

초록

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면역 측정법은 수많은 분자 표적의 검출을위한 중요한 검사입니다. 현재 사용 가능한 방법 중에서 세포 측정 비드 분석은 최근 수십 년 동안 두각을 나타내고 있습니다. 장비에서 판독하는 각 마이크로스피어는 테스트 중인 분자 간의 상호 작용 용량에 대한 분석 이벤트를 나타냅니다. 이러한 수천 개의 이벤트가 단일 분석에서 판독되므로 높은 분석 정확도와 재현성이 보장됩니다. 이 방법론은 질병 진단을 위한 IgY 항체와 같은 새로운 투입물의 검증에도 사용할 수 있습니다. 이 항체는 관심 항원으로 닭을 면역시킨 다음 동물 알의 노른자에서 면역 글로불린을 추출하여 얻습니다. 따라서 이것은 항체를 얻기위한 고통이없고 매우 생산적인 방법입니다. 이 분석법의 항체 인식 능력에 대한 고정밀 검증을 위한 방법론 외에도 이 논문은 이러한 항체를 추출하고, 항체와 라텍스 비드에 대한 최상의 결합 조건을 결정하고, 검사의 민감도를 결정하는 방법을 제시합니다.

서론

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질병 진단을 목표로 하는 면역분석 기법 중에서, 세포측정 비드 분석법은 단일 분석법으로 수천 개의 입자를 분석할 수 있기 때문에 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 접근법으로 부상하고 있다1. 이 기술은 생산성이 높고 소량의 샘플을 사용할 수있을뿐만 아니라 사이토 카인, 접착 분자, 항체 이소 타입 및 단백질 2,3과 같은 여러 분자를 검출 할 수 있기 때문에 유연성이 뛰어납니다.

이러한 분석법의 개발에는 다양한 입자가 사용되며, 그 중 라텍스 비드는 효과적이고 저렴한 투입물입니다. 이들은 특정 분자의 공유 또는 비공유 결합을 허용하는 작용기 또는 단백질의 존재와 같은 표면에 변형을 나타낼 수 있습니다 3,4,5.

이러한 면역검정은 항원 및 항체와 같은 성분을 사용하여 질병 마커의 검출을 수행하며 일반적으로 생쥐, 토끼 및 염소와 같은 포유류의 항체....

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프로토콜

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알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 달걀 노른자에서 IgY 추출

  1. 계란의 위생
    1. 달걀(갓 낳은 것 또는 낳은 후 4일까지, 갈루스 갈루스 데칼브 화이트 혈통에서)을 0.2% 희석된 차아염소산나트륨 용액에 담그고 흐르는 물에 빠르게 헹구고 나중에 또는 즉시 사용할 수 있도록 부드럽게 닦습니다.
      알림: 즉시 사용하지 않을 경우 최대 15일 동안 4°C에서 보관하십시오.
  2. 노른자의 분리
    1. 계란을 조심스럽게 깨고 노른자 분리기를 사용하여 노른자를 흰색에서 분리하십시오.
    2. 여과지를 사용하여 여분의 흰색을 제거하십시오. 노른자를 뚫고 내부를 50mL 원뿔형 튜브에 모은다. 사용하기 전에 노른자를 -20 °C에서 최소 24시간 동안 보관하십시오.
      참고: 이러한 실험(데이터는 표시되지 않음) 동안 이전에 냉동되지 않은 노른자를 사용하면 노른자의 지질 부분에서 면역글로불린이 분리되는 것을 방해하는 것으로 관찰되었습니다.
  3. 노른자의 산성화
    1. 저장된 노른자를 해동하....

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결과

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그림 2는 산성화를 통한 IgY 항체의 추출 과정과 카프릴산을 사용한 분리를 그래픽으로 보여줍니다(그림 2).

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그림 2: IgY 항체의 추출 단계 및 카프릴산을 사용한 분리의 개략도 . (A) 노른자의 분리, 원추형 튜브에서의 회수 및 냉동. (b) 난황 희석, pH 5로 조절. (C) 용액의 원심분리 및 상등액의 여과. (D) 카.......

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토론

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pH 감소에 의한 IgY 항체의 침전 후 카프릴산을 이용한 지질 분리의 방법은 기능성 손실 없이 전체 항체를 분리하는데 효율적이다. 여기에서 제안된 방법은 Redwan et al.11에 의해 보고된 방법보다 간단하고 저렴하며, 산성화 및 카프릴산에 의한 침전도 사용했지만 더 복잡하고 힘든 프로토콜을 사용했습니다. 이 방법은 또한 PEG 침전 12,13, 황산나트륨 14,15 및 클로로포름 16을 사용하는 것과 같이 달걀 노른자에서 IgY 분리를 위해 일반적으로 사용되는 방법론에 비해 이점을 제공합니다. 이 연구에서, 카프릴산을 사용하여 지질 분리 전후에 추출된 항체 샘플의 전기영동 프로파일은 유사하였고, 동일한 프로파일을 나타냈다. 그러.......

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공개 사항

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저자는 이 기사의 연구, 저자 및 출판과 관련하여 잠재적인 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

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장학금을 제공해주신 FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), 생명공학 대학원 프로그램(PPGBIOTEC at the Universidade Federal do Amazonas - UFAM), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) 및 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM)에 장학금을 제공해주신 데 대해 감사드립니다. 그림 2와 그림 4는 biorender.com 로 만들어졌습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
안티-치킨 IgY (H+L), 고함량 교차 흡착, CF  당나귀Sigma-AldrichSAB4600031
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)에서 생산된 488A 항체2시그마-알드리치SAB4600388
BD FACSCanto IIBD 생명과학BF-FACSC2
BD FACSDiva CS& T 연구 비즈 (CS & T 연구 비드)BD Biosciences655050
BD FACSDiva 소프트웨어 7.0BD Biosciences655677
Bio-Rad 단백질 분석 염료 시약 농축Bio-Rad#5000006
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA4503
Caprilic acidSigma-AldrichO3907
Centrifuge 5702 REppendorfZ606936
Chloride 37% acid molecular gradeNEON02618 NEON
CML latex, 4% w/vInvitrogenC37253
Megafuge 8RThermo ScientificTS-HM8R
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC)Sigma-AldrichE7750-1G
N-하이드록시숙신이미드(NHS)시그마-알드리치130672-25G
인산염 완충 식염수시그마-알드리치1003335620
수산화나트륨Acs CientificaP.10.0594.024.00.27
차아염소산나트륨Acs CientificaR09211000
온도 믹서 가열/냉각KASVIK80-120R
액

참고문헌

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  1. Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407(2019).
  2. de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M.

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재인쇄 및 허가

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태그

IgY

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