인간 세포주에서 핵 lncRNA의 장기간 녹다운을 위한 도구로서의 안티센스 올리고뉴클레오티드

Rogelio Montiel-Manriquez; Clementina Castro-Hernández; Cristian Arriaga-Canon; Luis A. Herrera

doi:10.3791/65124

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방법 논문

인간 세포주에서 핵 lncRNA의 장기간 녹다운을 위한 도구로서의 안티센스 올리고뉴클레오티드

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DOI:

10.3791/65124

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2023년 9월 1일

Rogelio Montiel-Manriquez¹ , Clementina Castro-Hernández¹ , Cristian Arriaga-Canon¹ , Luis A. Herrera¹^,²

¹Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer, Instituto Nacional de Cancerología-Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, ²Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnológico de Monterrey

이 논문에서

요약

염색체 불안정성과 같은 시간 의존적 과정에서 lncRNA의 기능을 분석하려면 장기간의 녹다운 효과를 달성해야 합니다. 이를 위해 여기에 제시된 프로토콜은 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 21일 동안 세포주에서 효과적인 녹다운을 달성하는 프로토콜입니다.

초록

긴 비암호화 RNA(lncRNA)는 전사 수준에서 유전자 발현에 중요한 조절 역할을 합니다. 실험적 증거는 lncRNA의 상당한 부분이 핵에 우선적으로 축적된다는 것을 입증했습니다. 핵 lncRNA의 기능을 분석하기 위해서는 핵 내부에서 이러한 전사체를 효율적으로 녹다운하는 것이 중요합니다. 세포질 침묵 기계에 의존하는 기술인 RNA 간섭의 사용과 대조적으로, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO) 기술은 핵 RNA 절단을 위해 RNase H를 RNA-DNA 듀플렉스에 모집하여 RNA 녹다운을 달성할 수 있습니다. 염색질 상태의 가능한 변경이 발생할 수 있는 게놈 엔지니어링에 CRISPR-Cas 도구를 사용하는 것과 달리 ASO는 게놈을 수정하지 않고 핵 전사체를 효율적으로 녹다운할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 ASO 매개 녹다운의 주요 장애물 중 하나는 일시적인 효과입니다. lncRNA 침묵의 오래 지속되는 효과에 대한 연구를 위해서는 장기간 동안 효율적인 녹다운을 유지하는 것이 필요합니다. 본 연구에서는 21일 이상 녹다운 효과를 얻을 수 있는 프로토콜을 개발하였다. 그 목적은 시간과 세포 노화를 통해서만 관찰되는 상태인 염색체 불안정성과 관련된 인접한 코딩 유전자 RFC4에 대한 lncRNA 녹다운의 시스 조절 효과를 평가하는 것이었습니다. 두 개의 서로 다른 인간 세포주, 즉 정상 원발성 전립선 상피 세포인 PrEC와 결장직장 암종에서 분리된 상피 세포주인 HCT116을 사용하여 분석된 세포주에서 성공적인 녹다운을 달성했습니다.

서론

인간 게놈의 대다수는 전사되어 lncRNA를 포함한 다양한 전사체를 생성하며, 이는 인간 전사체에서 주석이 달린 코딩 유전자의 수를 초과합니다¹. LncRNAs는 단백질을 암호화하지 않는 200개의 뉴클레오티드보다 긴 전사체이며^{, 2,3} 세포⁴에서 중요한 조절 기능에 대해 최근에 검사되었습니다. 그들의 기능은 lncRNAs의 상당한 부분이 축적되고 활발하게 전사 조절⁶ 및 핵 구조 유지 보수⁷에 참여하는 핵과 같은 세포 내 국소화⁵에 의존하는 것으로 나타났습니다⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰ .

핵 lncRNA의 기능적 특성화를 위해서는 핵에서 녹다운(KD)을 유도할 수 있는 방법을 사용해야 하며, ASO는 핵 전사....