현재 논문은 식물 관련 내생균의 분리, 분리물의 장기 보존, 형태학적 특성 분석 및 후속 분자 식별 및 균유전체 분석을 위한 전체 DNA 추출을 위한 상세하고 적절한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다.
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방법 논문
Mycoheterotrophic 식물에서 내생균 균류를 식별하기 위한 분리, 특성화 및 전체 DNA 추출
이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
Mycoheterotrophic 식물은 가장 극단적 인 형태의 균근 의존성 중 하나를 나타내며 독립 영양 능력을 완전히 잃었습니다. 다른 중요한 자원과 마찬가지로 이 식물과 밀접하게 연관되어 있는 균류는 식물에게 필수적입니다. 따라서 mycoheterotrophic 종을 연구하는 데 가장 관련성이 높은 기술 중 일부는 관련 균류, 특히 뿌리 및 지하 기관에 서식하는 균류를 조사할 수 있는 기술입니다. 이러한 맥락에서, 배양 의존적 및 배양 비의존성 내생균을 식별하기 위한 기술이 일반적으로 적용된다. 곰팡이 내생식물을 분리하는 것은 형태학적으로 식별하고, 다양성을 분석하고, 난초 종자의 공생 발아에 적용하기 위한 접종물을 유지하는 수단을 제공합니다. 그러나 식물 조직에 서식하는 다양한 비배양 균류가 있는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 배양에 독립적인 분자 식별 기술은 종의 다양성과 풍부도에 대한 더 넓은 범위를 제공합니다. 이 기사는 두 가지 조사 절차, 즉 문화 종속 및 독립 조사 절차를 시작하는 데 필요한 방법론적 지원을 제공하는 것을 목표로 합니다. 배양 의존적 프로토콜과 관련하여, 균종속영양 식물의 지하 및 공중 기관에서 사상균을 분리하고, 분리물을 수집하고, 슬라이드 배양 방법론에 의한 균사를 형태학적으로 특성화하고, 전체 DNA 추출을 통해 균류의 분자 식별과 함께 채취 장소에서 실험실 시설까지 식물 샘플을 수집하고 유지하는 과정이 자세히 설명되어 있습니다. 배양에 독립적인 방법론을 포괄하는 세부 절차에는 메타게놈 분석을 위한 식물 샘플 수집과 상용 키트를 사용하여 아클로로필 식물 장기에서 전체 DNA 추출이 포함됩니다. 마지막으로, 연속성 프로토콜(예: 중합효소연쇄반응[PCR], 염기서열분석)도 분석을 위해 제안되며, 여기에 기술이 제시됩니다.
서론
내생균(endophytic fungi)은 식물 장기와 조직의 내부에 눈에 띄지 않는 감염(즉, 숙주에게 해를 끼치지 않고)에 서식하는 균류입니다.1,2. 이러한 균류는 숙주 식물과 중성 또는 유익하게 상호 작용할 수 있고, 병원균 및 불리한 환경 조건에 대한 저항성을 부여할 수 있으며, 식물에 유익한 화합물(예: 성장 인자 및 기타 식물 호르몬)의 합성에 기여할 수 있습니다1,3. 균근 내생식물(Mycorrhizal endophytes)은 식물과 균근 결합을 이루는 균류로, 영양소 전달에 참여한다4. Orchidaceae에서 균근 내생식물과의 상호 작용은 대다수의 종에서 종자 발아와 가족의 모든 식물에서 묘목 설립에 기본입니다5. 이러한 맥락에서, 진균 종속영양 난초는 전체 생애 주기 동안 이러한 균류에 의한 미네랄 영양소와 탄소 화합물 전달에 의존하기 때문에 균근 파트너에 대한 완전한 의존의 경우를 나타낸다6. 따라서 연관 균류의 분리 및 식별은 mycoh....
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프로토콜
1. 식물 시료 채취
- culture-dependent method에 대한 샘플 수집
- 지하 기관을 조심스럽게 파십시오. 이들은 수집할 식물의 뿌리, 줄기, 뿌리줄기 또는 저장 기관일 수 있습니다. 매우 조밀한 토양 외에도 이러한 샘플을 손으로 수집하십시오.
알림: 이 단계에서 흙손이나 스쿱과 같은 도구를 사용하는 것은 진균종속영양 식물의 취약한 구조를 손상시킬 수 있고 비내생균에 의한 조직 오염을 유발할 수 있으므로 권장되지 않습니다. - 가능한 한 많은 지하 장기를 수집하십시오. 샘플을 냉각된 용기(예: 폴리스티렌 폼 상자 또는 얼음이 든 보온 백) 안에 종이 봉지에 보관합니다. 공중 기관도 수집되는 경우 지하 기관과 별도로 운송하십시오.
- 지하 기관을 조심스럽게 파십시오. 이들은 수집할 식물의 뿌리, 줄기, 뿌리줄기 또는 저장 기관일 수 있습니다. 매우 조밀한 토양 외에도 이러한 샘플을 손으로 수집하십시오.
- culture-independent method에 대한 샘플 수집
- 1.1.1 단계의 NOTE에 지적된 것과 동일한 권장 사항에 따라 수집할 식물의 뿌리를 조심스럽게 파십시오.
- 가능한 한 많은 지하 장기를 수집하십시오. 수집된 시료를 액체 질소 내부의 극저온 튜브에 보관하거나(바람직한 옵션) 드라이아이스로 둘러싸인 원심분리기 튜브를 사용하십시오(대체 옵션). 공중 장기를 수집하는 경우 별도로 유지 관리하십시....
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결과
격리 프로토콜에서 마지막 세척에 사용된 물로 인한 오염이 있고 접종된 파편이 있는 페트리 접시에서도 오염이 검출되는 것을 고려하면 오염 물질의 유형에 따라 다른 조치를 취할 수 있습니다(표 1). 이 절차는 포자가 많은 곰팡이 오염 물질의 경우 처음부터 반복해야 하며, 이는 또한 성장을 가속화하고 선택한 항생제에 내성이 있는 강렬한 증식 박테리아를 나타냅니다. 대신, 곰팡이 오염 물질이 느린 성장을 나타내거나 포자가 형성되지 않는 경우, 프로토콜의 후속 단계에서 분리하는 것을 피할 수 있습니다. 마지막으로, 천천히 증식하는 박테리아 균주에 의한 오염은 균사를 회수할 때 후방 단계, 특히 정제에서 쉽게 피할 수 있습니다.
이전에 제시된 모든 사례에서 이상적인 시나리오는 내성 박테리아가 첫 번째 접.......
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토론
식물 샘플의 표면적 소독은 제시된 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다. PDA 접시에 마지막 세척 물방울이 있는 오염이 없는 것은 매우 바람직합니다. 박테리아는 격리 접시에서 오염 물질로 자주 관찰되며, 일반적으로 공기 중 포자 균류보다 더 많으며, 내생균은 식물 조직 내에서도 흔하다는 점을 고려하면 3,11. 따라서 장기 절편을 설치할 때 배양 배지에 항생제를 첨가하는 것이 필수적입니다. 다양한 유형의 항생제를 결합할 때 더 나은 결과를 얻을 수 있으며, 그 결과 작용의 스펙트럼이 더 넓어집니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 PDA와 AA를 사용하면 필연적으로 특정 종을 선택하고 다른 종을 선호하지 않기 때문에 곰팡이를 분리하는 데 내재된 편향입니다. 다른 배양 배지의 조합은 편향을 최소화할 수 있지만, 그러한 한계를 없애지는 못한다9.
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없으며 이해 상충도 없습니다.
감사의 글
FAPESP(2015/26479-6) 및 CNPq(447453/2014-9)의 자금 지원에 감사드립니다. JLSM은 생산성 보조금에 대해 CNPq에 감사드립니다(303664/2020-7). MPP는 Capes(석사 학위 장학금, 프로세스 88887.600591/2021-00)와 CNPq에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 접착 테이프 | (모든 회사에서, 미세형태학적 분석에서 접착 테이프 장착용) | ||
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A5354 | (식물 조각 설치용, 다른 항생제 사용 가능 - 2.2.1단계 확인) |
| 오토클레이브 | (모든 회사에서, 여러 단계의 재료 살균용) | ||
| 세균학 한천 | Sigma-Aldrich | A1296 | (많은 단계) |
| C1, C2, C3, C4, C5, C6 솔루션 | Qiagen | 12888-50 | (DNeasy PowerSoil 키트와 함께 구매) |
| 원심분리기 | Merck/Eppendorf | 5810 G | (진균 분리물에서 총 DNA 추출용) |
| 원심분리기 튜브 | Merck | CLS430828 | (시료 채취용) |
| 클로로포름 | Sigma-Aldrich | C2432 | (진균 분리물에서 총 DNA 추출용) |
| 콩고 레드 | Supelco | 75768 | (균사 염색용) |
| Cryotubes | Merck | BR114831 | (용) 많은 단계) |
| 에탄올 | Supelco | 100983 | 적절한 희석을 수행해야 합니다(여러 단계) |
| 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) | 시그마-알드리치 | 3609 | (곰팡이 분리물에서 총 DNA 추출) |
| 여과지 | 머크 | WHA10010155 | (여러 단계) |
| 유리 시험관 | 머크 | CLS7082516 | (껍질을 벗기지 않은 쌀알의 냉동 보존을 위해) |
| 유리솜 | Supelco | 20411 | (껍질을 벗기지 않은 쌀알의 냉동 보존 용) |
| 포도 | 시그마 -알드리치 | G8270 | 또는 포도당 (질석의 냉동 보존 용) |
| 글리세롤 | 시그마 -알드리치 | G5516 | 또는 글리세린 (질석의 냉동 보존, LPCB 준비 용) |
| 이소프로판올 | 시그마-알드리치 | 563935 | (곰팡이에서 총 DNA 추출 용) 분리) |
| 젖산 | 시그마-알드리치 | 252476 | (LPCB - 균사 염색 준비용) |
| 락토페놀 블루 용액(LPCB) | 시그마-알드리치 | 61335 | (균사 염색용) |
| 층류 후드 | (클래스 I, 모든 회사, 여러 단계) | ||
| 광학 현미경 | (모든 회사, 균사 관찰용) | ||
| MB 스핀 컬럼 | Qiagen | 12888-50 | (DNeasy PowerSoil 키트와 함께 구매) |
| 메틸블루(코튼 블루) | Sigma-Aldrich | M5528 | (LPCB - 균사 염색 준비용) |
| 미세원심분리기 튜브(1.5mL) | Merck | HS4323 | (곰팡이 분리물에서 총 DNA 추출용) |
| 미세원심분리기관(2mL) | Merck | BR780546 | (여러 단계용) |
| 미네랄 오일 | (곰팡이 분리물 보존용) | ||
| 종이 봉지 | 평균 크기 150mm x 200mm(샘플 채취용) | ||
| 페트리 접시(유리, 120mm x 20mm) | Merck/Pyrex | SLW1480/10D | (오토클레이브 가능, 곰팡이 슬라이드 배양용, 높은 것 선호) |
| 페트리 접시(유리, 50mm x 17mm) | Merck/Aldrich | Z740618 | (곰팡이 분리 물의 정제를 위해); 대안 : 폴리스티렌 페트리 접시 (멸균, γ -방사선 조사, 비 오토 클레이브) |
| 페트리 접시 (유리, 80 mm x 15 mm) | Merck / Brand | BR455732 | (식물 조각 설치 용); 대안 : 폴리스티렌 페트리 접시 (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable) |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | (곰팡이 분리 물에서 총 DNA 추출, LPCB 준비) |
| 도자기 모르타르 | Sigma-Aldrich | Z247464 | (진균 분리물에서 총 DNA 추출용) |
| 도자기 유봉 | Sigma-Aldrich | Z247502 | (진균 분리물에서 총 DNA 추출용) |
| 감자 포도당 한천(PDA) | Millipore | P2182 | (여러 단계용) |
| PowerBead 튜브 | Qiagen | 12888-50 | (DNeasy PowerSoil 키트와 함께 구매) |
| 신속한 장착 매체 (Entellan) | Sigma-Aldrich | 1.0796 | (곰팡이 슬라이드 배양용) |
| 실리카겔 | Supelco | 717185 | 껍질을 벗기지 않은 쌀알의 동결 보존용) |
| 염화나트륨(NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | (곰팡이 분리물에서 총 DNA 추출용) |
| 도데실황산나트륨(SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | 라우릴 설페이트 나트륨염(총 DNA 추출용) 곰팡이 분리물에서) |
| 차아염소산나트륨(2% 활성 염소 포함)( | 상용 제품, 표재성 박멸용) | ||
| 토양 DNA 추출 키트(DNeasy PowerSoil 키트) | Qiagen | 12888-50 | (식물 기관에서 총 DNA 추출용) |
| 분광 광도계 - Nanodrop 2000/2000c | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | (식물 기관에서 총 DNA 추출용) |
| 실체현미경 | (=해부 현미경, 모든 회사, 거대 형태 분석용) | ||
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | (식물 조각 설치용) |
| Thermoblock | Merck/Eppendorf | EP5362000035 | (또는 타사 제품) |
| 조직 균질화 및 세포 용해기 | SPEX SamplePrep | 2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (식물 기관에서 총 DNA 추출용) | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich/Harleco | 364-M | (균사 염색용) |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T9531 | (질석의 동결 보존용) |
| Tris Base Solution (Tris) | Sigma-Aldrich | T1699 | (곰팡이 분리물에서 총 DNA 추출용) |
| 껍질을 벗기지 않은 쌀알 | (냉동 보존용) | ||
| U자형 유리 막대 | (또는 적응 - 곰팡이 슬라이드 배양을 위한 5.4.1단계 확인) | ||
| 질석 | 미세 과립계(질석의 동결 보존용) | ||
| Vortexer | Sigma-Aldrich/BenchMixer | BMSBV1000 | 곰팡이 분리물에서 총 DNA 추출용) |
| 효모 추출물 | Sigma-Aldrich | Y1625 | (질석의 냉동 보존) |
참고문헌
- de Azevedo, J. L. Endophytic microorganisms. Ecologia Microbiana. , 117-137 (1998).
- Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. An overview of endophytic microbes: endophytism defined. Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).
- Schulz, B., Boyle, C. What are Endophytes.
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
to:
Juliana Lischka Sampaio Mayer
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