이 프로토콜은 Mycobacterium smegmatis(Msm)의 액센 배양에서 천연 마이코박테리아 세포외 소포체(mEV)의 농축과 mCherry(적색 형광 리포터) 함유 재조합 MsmEV를 설계하고 농축할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 EsxA 단백질을 함유한 MsmEV의 농축을 통해 새로운 접근법을 검증합니다.
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방법 논문
마이코박테리아의 native and recombinant extracellular vesicles 농축
이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
마이코박테리아를 포함한 대부분의 박테리아는 세포외 소포체(EV)를 생성합니다. 박테리아 EV(bEV)에는 대사 산물, 지질, 단백질 및 핵산을 포함한 세포 구성 요소의 하위 집합이 포함되어 있기 때문에 여러 그룹에서 서브유닛 백신 후보로서의 보호 효능에 대해 bEV의 네이티브 또는 재조합 버전을 평가했습니다. 네이티브 EV와 달리 재조합 EV는 하나 이상의 관심 면역원을 포함하도록 분자 공학적으로 설계되었습니다. 지난 10년 동안 여러 그룹에서 재조합 bEV를 생성하기 위한 다양한 접근 방식을 탐구했습니다. 그러나 여기서는 마이코박테리아에서 재조합 마이코박테리아 EV(mEV)의 설계, 구성 및 농축을 보고합니다. 이를 위해 우리는 무독성 토양 마이코박테리움인 Mycobacterium smegmatis (Msm)를 모델 시스템으로 사용합니다. 먼저 Msm의 네이티브 EV의 생성과 강화에 대해 설명합니다. 그런 다음 적색 형광 리포터 단백질인 mCherry 또는 Mycobacterium tuberculosis의 저명한 면역원인 EsxA(Esat-6)를 포함하는 재조합 mEV의 설계 및 구성에 대해 설명합니다. mCherry와 EsxA N-말단을 작은 Msm 단백질 Cfp-29의 C-말단과 별도로 융합하여 이를 달성합니다. Cfp-29는 MsmEV에 풍부하게 존재하는 몇 안 되는 단백질 중 하나입니다. Msm에서 재조합 mEV를 생성하고 농축하는 프로토콜은 Msm의 네이티브 EV의 생성 및 농축과 동일하게 유지됩니다.
서론
전염병에 대한 광범위한 백신의 개발 및 투여에도 불구하고 오늘날까지도 모든 인간 사망의 ~30%는 여전히 전염병으로 인해 발생합니다1. 결핵(TB) 백신인 Bacillus Calmette Guerin(BCG)이 등장하기 전에는 결핵이 사망 원인 1위였습니다(~10,000명에서 15,000명/100,000명)2. BCG의 투여와 1차 및 2차 항결핵제에 대한 쉬운 접근으로 2022년까지 결핵 관련 사망은 2022년까지 ~100만명/년으로 급격히 감소했다(즉, ~15-20/100,000 인구1). 그러나 전 세계 결핵 풍토병 인구에서 결핵 관련 사망자는 인구 100,000명당 ~100-550명에 머물고있다 1. 전문가들은 이러한 왜곡된 수치를 초래하는 몇 가지 이유를 인정하지만, BCG에 의한 보호가 생후 첫 10년 동안도 지속되지 않는 것이 3,4,5,6,7의 주된 원인인 것으로 보인다.<....
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프로토콜
1. Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli 및 그 유도체의 성장 조건
- 미디어
- 미들브룩 7H9 액체 육수
- 유리 비커에 필요한 양의 이중 증류수(ddw)를 전자레인지에서 ~45-50oC로 사전 데워 20% Tween-80 원액을 준비하고, 적절한 측정 실린더를 사용하여 필요한 부피의 Tween-80을 추가하고, 작은 자석 교반기에서 계속 저어 20% Tween-80을 균일한 용액으로 만듭니다. 0.22um 폐기 필터를 통해 20% 트윈-80을 여과하고 옅은 노란색 원액을 4°C에서 보관합니다.
참고: 정확한 최종 농도를 위해 측정 실린더에 있는 Tween-80의 모든 흔적을 비커로 옮겨야 합니다. 준비된 Tween-80 스톡을 고압멸균하지 마십시오. 필터(0.22μM 사용)를 살균하여 4 °C에서 보관합니다. - 7H9 육수 준비에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오. 4.7g의 7H9 분말을 900mL의 ddw에 현탁시킵니다. 글리세롤 2mL를 넣고 내용물을 혼합한 후 121oC, 15psi에....
- 유리 비커에 필요한 양의 이중 증류수(ddw)를 전자레인지에서 ~45-50oC로 사전 데워 20% Tween-80 원액을 준비하고, 적절한 측정 실린더를 사용하여 필요한 부피의 Tween-80을 추가하고, 작은 자석 교반기에서 계속 저어 20% Tween-80을 균일한 용액으로 만듭니다. 0.22um 폐기 필터를 통해 20% 트윈-80을 여과하고 옅은 노란색 원액을 4°C에서 보관합니다.
- 미들브룩 7H9 액체 육수
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결과
M. smegmatis(Msm)를 모델 마이코박테리움으로 사용하여 네이티브 및 재조합 mEV(R-mEV)의 농축을 입증합니다. 이 개략적으로 요약된 mEV 농축 프로토콜(그림 1)은 Msm의 R-mEV 및 Mtb의 네이티브 EV의 농축에도 작동합니다(1.2의 프로토콜 노트에서와 같이 약간의 수정 포함). 농축된 mEV를 시각화하려면 투과 전자 현미경(36)으로 음성으로 염색해야 합니다(그림 2A). 일반적으로 Msm 특이적 EV는 13mL 6-60% 밀도 구배의4th-6th 1mL 분획에서 분리됩니다(그림 2B). EV에 해당하는 약 80-100μg의 단백질은 Msm의 중간 로그 액상 배양 2L에서 일상적으로 얻어집니다. 직경은 일반적으로 20nm에서 250nm 사이입니다(.......
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토론
BCG보다 우수하고 BCG를 대체할 수 있는 새로운 결핵 백신을 개발하는 것은 여전히 만만치 않은 과제로 남아 있기 때문에, 대안으로 여러 그룹에서 BCG의 효능을 높이고 보호 기간을 연장할 수 있는 다양한 소단위 결핵 백신의 발견을 추구하고 있습니다48,49. 박테리아 EV(bEV)가 잠재적인 소단위체(subunit) 및 천연 보조제(natural adjuvants)50,51)로서 증가함에 따라, 다운스트림 테스트/분석을 위해 충분한 양의 mEV를 지속적으로 농축하는 것이 중요한 단계가 되었습니다. 이러한 연구 질문을 고려하여 이 프로토콜은 액센 배양과 재조합 버전의 mEV를 농축하는 것을 목표로 합니다.
Msm EV의 상세한 질량 분광 단백질체 분석 중에 Prados-.......
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공개 사항
모든 저자는 이 연구 작업이 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계/이해관계가 없는 상태에서 수행되었음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 M. smegmatis mc2155 주식을 친절하게 공유해 주신 Sarah M. Fortune 교수에게 진심으로 감사드립니다. 또한 그림 1의 몇 가지 기본 요소를 제공한 Servier Medical Art(smart.servier.com)를 인정합니다. 그들은 mEV 농축을 위해 인큐베이터 쉐이커, 원심분리기 및 초원심분리기를 장기간 사용하는 동안 환자 조정에 대한 나머지 실험실 구성원의 지원에 진심으로 감사드립니다. 또한 실험실 조교인 Surjeet Yadav 씨가 필요한 유리 제품과 소모품을 항상 사용할 수 있고 편리하게 사용할 수 있도록 해준 것에 대해 감사를 표합니다. 마지막으로, 그들은 프로젝트의 원활한 실행에 대한 지속적인 지원과 도움에 대해 THSTI의 관리, 구매 및 재무 팀에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| A2 유형 생물 안전 캐비닛 | Thermo Fisher Scientific, 미국 | 1300 시리즈 | |
| 벤치 탑 원심 분리기 | Eppendorf, 미국 | 5810 R | |
| BstB1, HindIII, HpaI | NEB, USA | NEB | |
| 세포 농도계 | GE Healthcare, 미국 | Ultraspec 10 | |
| 구연산 | Sigma-Aldrich, Merck, 미국 | Sigma Aldrich | |
| 이염기성 인산칼 | Sigma-Aldrich, Merck, 미국 | Sigma Aldrich | |
| 이중 증류수 | Merck, USA | ~18.2 MW/cm @ 25 oC | |
| Electroporation 큐벳 | Bio-Rad, 미국 | 2 mm | |
| Electroporator | Bio-Rad, 미국 | Electroporator | |
| EsxA 특이적 Ab | Abcam, 영국 | 토끼 폴리 클로날 | |
| 철 암모늄 구연산 | 염 Sigma-Aldrich, Merck, 미국 | Sigma Aldrich | |
| 바닥 모델 원심 분리기 | Thermo Fisher Scientific, 미국 | Sorvall RC6 plus | |
| 유리 제품 | Borosil, INDIA | 1L 삼각 플라스크 | |
| 글리세롤 | Sigma-Aldrich, Merck, 미국 | Sigma Aldrich | |
| HEPES 및 염화 | 나트륨Sigma-Aldrich, Merck, 미국 | Sigma Aldrich | |
| 인큐베이터 쉐이커 | Thermo Fisher Scientific, 미국 | MaxQ 6000 & 8000 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich, Merck, 미국 | Sigma Aldrich | |
| Luria Bertani Broth and Agar, Miller | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Magnetic stirrer | Tarsons, INDIA | Tarsons | |
| mCherry 특정 Ab | Abcam, 영국 | 토끼 단클론 | |
| 마이크로파 | LG, 인도 | ||
| MC3286BLT Middlebrook 7H9 Broth | BD, 미국 | Difco Middlebrook 7H9 Broth | |
| Middlebrook ADC 농축 | BD, 미국 | BBL Middlebrook ADC 농축 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, 미국 | Spectronic 200 UV-Vis | |
| NEB5a | NEB, 미국 | DH5a | |
| Optiprep(Iodixanol) | Merck, 미국 | 60% 원액으로 사용 가능(물에서) | |
| PCR 정제 키트 | Hi Media, 인도 | Hi Media | |
| pH 측정기 | Mettler Toledo, 미국 | Mettler Toledo | |
| 플라스미드 DNA 미니 키트 | Hi Media, 인도 | Hi Media | |
| Plate incubator | Thermo Fisher Scientific, USA | 새로운 시리즈 | |
| Plasmid pMV261 | Addgene, USA * *The 플라스미드 이다 아니요 이 플라스미드 뱅크 | 셔틀 벡터 | |
| 교정 DNA 중합효소 | Thermo Fisher Scientific, 미국 | Phusion DNA Plus 중합효소 | |
| Q5 교정 DNA 중합효소 | NEB, USA | NEB | |
| 냉장 순환 수조 | Thermo Fisher Scientific, 미국 | R20 | |
| Middlebrock 7H11 한천 베이스 | BD, 미국 | BBL Seven H11 Agar base | |
| SOC broth | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| T4 DNA Ligase | NEB, USA | NEB | |
| Tween-80 | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, USA | Optima L100K | |
| 초원심분리기 튜브 - 14 mL | Beckman Coulter, 미국 | 폴리알로머 타입 – SW40Ti 로터의 초투명 타입 | |
| 초원심분리기 튜브 - 38 mL | Beckman Coulter, USA | 폴리프로필렌 타입– SW28 로터용 흐린 타입 | |
| 초음파 세척 수조 초음파 발생기 | Thermo Fisher Scientific, USA | 초음파 발생기 - 벤치 탑 모델 | |
| 0.22 &마이크로; m 일회용 필터 | Thermo Fisher Scientific, 미국 | Nunc-Nalgene | |
| 30-kDa 센트리콘 농축기 | Merck, USA | Amicon 울트라 원심 필터 - Millipore | |
| 3X FLAG 항체 | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
| 400 mL 원심분리기 병 | Thermo Fisher Scientific, USA | Nunc-Nalgene | |
| 50 mL 원심분리기 튜브 | 미국 | 무균, 사전 포장 | |
| < 강한> 박테리아 < / 강> | |||
| < 강> 균주 < / 강> | |||
| < > 대장균 < / em> | NEB, 미국 | NEB 5- 알파 (DH5 &alpha의 유도체). | |
| Msm 표현 cfp29::mCherry | 이 연구 | MC2 155 | |
| Msm 표현 cfp29::esxA | 이 연구 | MC2 155 | |
| Msm 표현 cfp29::esxA::3X FLAG | 이 연구 | MC2 155 | |
| Mycobacterium smegmatis (Msm) | 미국 하버드 대학교 | MC2 155 |
참고문헌
- Global Tuberculosis Report 2022. , https://www.who.int/publications/m/item/global-tb-report (2022).
- Luca, S., Mihaescu, T. History of BCG vaccine. Mædica. 8 (1), 53-58 (2013).
- Palmer, C. E., Long, M. W. Effects of infection with atypical mycobacteria on BCG vaccination and ....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 2/01/2024. Citeable Link.
An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University
