Bacillus subtilis 포자 계수 및 유세포 분석의 표지 분석 개선

요약

이 프로토콜은 유세포 분석 및 카운팅 비드를 사용하여 에티듐 브로마이드로 표지된 박테리아 포자를 정량화하는 데 중점을 둡니다. 이 방법은 또한 온전한 포자의 표면에서 단백질의 공유 결합을 분석하는 데 효율적입니다.

초록

Bacillus subtilis의 포자는 이미 다른 생명 공학 및 면역 학적 응용 분야에 대해 제안되었습니다. 그러나 포자 표면에 고정된 항원의 검출과 정량화를 개선하는 방법론의 개발이 점점 더 필요해지고 있습니다. 유세포 분석 기반 분석은 이전에 B. subtilis의 표지된 세포를 검출하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있으며 특이적인 접근법으로 제안되었습니다. 여기에서, 우리는 유세포 분석의 사용을 사용하여 포자 표면에 형광 항체(FA)의 표시 효율을 평가하고 계수 비드를 사용하여 포자 수를 정량화할 것을 제안합니다.

이를 위해 에티듐 브로마이드를 DNA 마커로 사용하고 포자에 결합된 알로피코시아닌(APC) 표지 항체를 표면 마커로 사용했습니다. 포자의 정량화는 이 기술이 세포 검출에서 높은 정확도를 보여주기 때문에 계수 비드를 사용하여 수행되었습니다. 표지된 포자는 유세포 분석기를 사용하여 분석되었으며, 이는 결합을 확인했습니다. 그 결과, DNA 라벨링이 발아된 포자의 검출을 위해 유세포 분석에 의한 정량화의 정확도를 향상시킨다는 것이 입증되었습니다. 에티듐 브로마이드는 휴면 포자를 라벨링 할 수 없다는 것이 관찰되었습니다. 그러나, 이 기술은 그들의 표면에 결합된 형광 단백질을 가진 포자의 수의 더 정확한 결심을 제공해, 따라서 다른 신청에 있는 생물공학 플랫폼으로 포자의 사용에 집중하는 학문의 발달에서 돕습니다.

서론

바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 막대 모양의 그람 양성 박테리아로, 환경 조건이 세포 성장을 허용하지 않을 때 정지된 포자를 생성할 수 있습니다¹. 포자는 매우 안정적인 세포 형태이며 B. subtilis를 포함한 여러 종의 포자는 인간 및 동물용 프로바이오틱스로 널리 사용됩니다². 내성 및 안전성 특성으로 인해 이종 단백질을 표시하는 B. subtilis의 포자는 점막 보조제, 백신 전달 시스템 및 효소 고정 플랫폼 ^3,4로 제안되었습니다.

B. subtilis에서 포자를 얻으려면 특수 배양 배지를 사용하여 영양 결핍에 노출시켜야 합니다. 이러한 포자를 얻고 정제한 후에는 테스트 효율을 향상시키기 위해 정량화해야 합니다 ^5,6. 따라서, 얻어진 포자의 농도를 분석하기 위해 특정 방법이 적용된다. 플레이트 카운팅 및 카운팅 챔버라고도 하는 Petroff-Hausser 챔버를 사용할 수 있습니다. 후자는 원래 혈액 세포의 농도를 결정하기 위해 개발되었습니다. 그러나 포자 계산 ^7,8을 위해 미생물학 분야에서 사용할 수 있습니다. 셀 카운팅에 사용되는 표준 방법임에도 불구하고 이 방법은 완전히 수동이고 정확도는 작업자의 경험에 따라 달라지기 때문에 판독이 어렵습니다.

유세포 분석 기반(FC) 분석은 이전에 Bacillus spp의 표지된 세포를 검출하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있으며 특이적인 접근법으로 제안되었습니다. 유세포 분석 계수 비드의 사용은 일상적인 검사(CD4 및 CD8 T 림프구의 절대 계수)에서 세포 계수와 유세포 분석을 사용하여 검출 및 계수할 수 있는 입자와 관련된 연구 개발에서 재현성을 보장합니다⁹. Godjafrey와 Alsharif는 표지되지 않은 포자의 FC 정량화를 위해 계수 비드의 사용을 제안했습니다¹⁰. 유세포 분석법의 사용은 Bacillus spp 의 포자 형성 모니터링을 위해 설명되었습니다.포자 DNA^10,11,12,13을 라벨링하는 것을 통해. 또 다른 연구에서는 포자 표면(¹⁵)에서 형광 표지된 단백질의 양을 평가하기 위해 FC를 사용하였다.

이 연구는 유세포 분석을 사용한 이벤트 계수와 관련하여 재현성 표준을 보장하기 위해 상업용 계수 비드를 사용하고자 했습니다. 여기서, 우리는 포자 계수를 미세 조정하고 포자 표면에서 형광 표지된 항체의 결합 효율을 평가하기 위해 FC에서 세포 계수를 위한 계수 비드의 사용을 제안합니다.

프로토콜

이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 기기 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 유세포 분석 설정

1. 컴퓨터에 결합된 유세포 분석기의 광학 파라미터 정렬
   1. Cytometer 소프트웨어에 로그인합니다.
   2. 소프트웨어 작업 공간에서 Cytometer | 시작하고 몇 분 정도 기다립니다 | 클린 모드 | 앉아서 액체를 섭취하십시오.
      참고: 기포와 장애물은 샘플 획득 전에 세포분석기 시작 과정에서 제거되었습니다.
2. 품질 관리
   1. 품질 관리 시약을 사용하여 광전자 증배관의 전압을 조정하고 감도를 평가합니다.
      1. 폴리스티렌 튜브에 품질 관리 시약을 준비합니다.
      2. 기준선을 정의하기 위해 0.5mL의 희석제(10mM 여과 PBS, pH 7)와 3방울의 비드를 라벨링된 튜브에 추가하여 현탁 비드를 준비합니다.
      3. 비드 바이알을 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.
   2. 소프트웨어 작업 공간에서 Cytometer | CST 인터페이스에 연결합니다. 몇 분 정도 기다렸다가 cytometer disconnected(세포분석기 연결이 끊어짐) 메시지를 확인합니다.
   3. 품질 관리 시약이 들어 있는 폴리스티렌 튜브를 유세포 분석기 프로브에 부착합니다.
3. 세포분석기의 구성 확인
   1. System Summary(시스템 요약) 창에서 유세포분석기 구성이 실험에 적합한지 확인합니다.
   2. 선택한 설정 비드 로트 ID가 현재 CS&T 연구 비드 로트와 일치하는지 확인하기 위해 해당 설정 비드 배치 ID를 선택합니다.
4. 성능 점검
   1. Check Performance(성능 확인) 옵션을 선택하고 Run(실행)을 클릭합니다.
   2. 성능 점검이 완료되면 성능 결과가 표시됩니다. 유세포분석기 성능 보고서를 확인하십시오. Finish( 마침 )를 클릭하여 성능 검사를 완료하거나 유세포 분석기에서 튜브를 제거하고 System Summary(시스템 요약 ) 창에서 결과를 검토합니다.
   3. 형태 측정 및 형광 민감도 분석의 최종 결과를 관찰합니다. | 시스템 요약| 세포분석기 성능 결과| 상태: 통과

2. 포자의 준비

1. 포자 형성 후 포자를 초순수 얼음 냉수로 3 배 헹굽니다.17,949 × g 에서 10 분 동안 원심 분리.
2. 마지막 원심분리에서 얻은 펠릿을 초순수 10mL로 재현탁시킵니다.
3. 식물 세포의 비활성화를 위해 121ºC에서 45분 동안 포자를 고압멸균합니다.
   참고: 다른 불활화 방법을 비교한 우리 그룹이 수행한 이전 테스트는 2.3단계에서 언급한 조건이 높은 효율을 나타내며 LB 한천 배지의 도금 분석 방법에서 콜로니 형성을 보여주지 않음을 보여주었습니다.

3. 유세포 분석을 사용한 오토클레이브 포자의 정량화

1. 50μL의 오토클레이브 포자를 0.05% v/v의 희석 계수로 30분 동안 에티듐 브로마이드(EtBr, 물에 희석된 10mg/mL)로 빛으로부터 보호하여 배양합니다(그림 1A).
2. 17,949 × g 에서 10분 동안 원심분리하여 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 포자를 3번 세척하고 1x PBS에 재현탁시킵니다.
3. 희석에 대한 제조업체의 권장 사항에 따라 10μL의 비드를 추가합니다.
4. 4단계에서 설명한 대로 유세포 분석기를 사용하여 샘플을 분석합니다.
   참고: 이 단계가 제대로 수행되지 않았을 때 계산에서 불균형이 관찰되었기 때문에 비드를 가능한 한 균질하게 피펫팅해야 한다는 점을 강조하는 것이 중요합니다.

4. 유세포 분석을 이용한 분석

1. Cytometer 소프트웨어에 로그인합니다.
2. 소프트웨어 작업 공간에서 Cytometer | 클린 모드 | 앉아서 액체를 섭취하십시오.
3. 작업 공간에 맞게 조정하여 유세포 분석에서 분석을 결정합니다.
   1. 분석을 위한 게이트를 정의합니다(그림 2).
      1. negative control(표시되지 않은 포자)을 기반으로 입자의 형태 측정 및 형광 특성을 기반으로 gating 전략을 정의합니다.
   2. 세포 형태 측정법을 결정하려면 x축의 FSC-A 파라미터 분석과 y축의 SSC-A 파라미터 분석을 위해 점도표 그래픽을 선택합니다.
   3. 형광을 확인하려면 x축에 FL5를 사용하여 y축에 대한 FL3 점도표 플롯을 선택하고 4개의 사분면에 게이트를 만듭니다.
4. 이전에 단색 EtBr, 단색 APC 및 다색 EtBr+ APC로 라벨링된 라벨링되지 않은 샘플이 들어 있는 12 x 75mm 마개 폴리스티렌 튜브를 사용합니다.
5. 음성 대조군이 들어 있는 튜브를 매우 부드럽게 혼합하고 유세포 분석기 프로브에 부착합니다.
6. Acquire(획득)를 클릭합니다.
7. Cytometer(세포분석기)로 이동하여 레이저의 출력을 설정합니다. 매개 변수 | FSC(375) 및 SSC(275).
8. 임계값을 (500)으로 설정합니다. 유세포분석기 | 임계값.
9. 자가형광을 제거하려면 포자만 포함된 무염료 시료를 분석합니다.
10. 필터 검출기 FL3(603) 및 FL5(538) 의 전압을 조정하여 대조군에서 선택한 형광에 대해 음수 및 양성 모집단을 구별합니다. 세포분석기 | 매개 변수.
11. 세포분석기 | 보상 | FL5/FL3 설정 오프셋 을 1.0으로 설정합니다.
12. 형태 측정 및 형광 분석 후 Acquisition 30,000 이벤트를 위한 장치 구성 | 실험 | 실험 레이아웃 | 획득 |30,000 이벤트....
13. 파라미터를 조정한 후 유세포 분석기에서 라벨링되고 비드를 포함하는 샘플에 대한 데이터를 수집합니다.
14. 방정식 (1)을 사용하여 제조업체의 지침에 설명된 대로 포자 농도를 계산합니다.
    (1)
    참고: 이 연구에서는 비드 정량화 방법을 Petroff-Hausser 계수 챔버 분석과 비교했습니다. 또한, 오토클레이브 포자의 라벨링은 비오토클레이브 포자의 라벨링과 비교되었습니다.

5. 유세포 분석을 이용한 포자 표면의 단백질 결합 지수 추정

1. 포자 50μL(10³/μL) 17,949 × g 을 10분 동안 원심분리하여 수확한 후, 25 μL의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)(300 mM)로 재현탁시킨다.
2. 실온에서 15분간 배양합니다.
3. 포자 현탁액에 25μL의 N-하이드록시설포숙신이미드(NHS)(50mM)를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
4. 3단계에 설명된 대로 원심분리를 통해 1x PBS로 포자를 5.1번 세척합니다.
5. 형광 단백질을 넣고 샘플을 15°C에서 하룻밤 동안 그대로 둡니다.
   참고: 이 연구에 사용된 형광 단백질은 APC 표지 항인간 IL-10 항체였습니다. EDC/NHS가 포자 표면의 단백질에 존재하는 -COOH와 -NH₂ 그룹 사이의 공유 결합을 촉진하기 때문에 다른 형광 분자의 적용이 가능하지만 이 항체는 연구를 위한 모델로 사용되었습니다.
6. 5.3 단계에 따라 포자를 씻습니다.
7. 1:50에 희석한 브롬화 에티듐 10mg/mL를 넣은 다음 얼음 위에서 1시간 동안 그대로 두고 빛으로부터 보호합니다(그림 1B).
8. 5.3 단계에 따라 포자를 씻습니다.
9. 4단계를 반복합니다.
10. 형광을 확인하려면 점도표의 X축에서 FL3 파라미터와 Y축에서 FL5 파라미터를 변경합니다.
11. 4단계에서 설명한 대로 FL3(670 LP 필터)의 청색 레이저(488nm)와 FL5(660/20 필터)의 적색 레이저(633nm)가 있는 유세포 분석기를 사용하여 샘플을 분석합니다.
    참고: 동일한 샘플을 현미경으로 1,000배의 배율 범위에서 FITC 480/30nm(녹색) 및 TRITC 540/25nm(빨간색) 필터를 사용하여 슬라이드의 면역형광을 분석했습니다.

결과

오토클레이브 포자(AS) 샘플에서 2 × 10³ 포자/μl 및 1 × 10³ 포자/μl는 각각 카운팅 비드와 Petroff-Hausser 방법을 사용하여 검출되었습니다(그림 2).

그림 1: 포자의 일반적인 정량화 계획. (A) EtBr로 표지된 포자 및 (B) 이중 표지된 포자. 약어: EDC = 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드; NHS = N-하이드록시설포숙신이미드.

토론

콜로니의 플레이트 카운팅과 같은 전통적인 방법은 시간이 많이 걸릴 뿐만 아니라 생존 가능한 세포가 필요하며 비활성화된 포자의 정량화를 허용하지 않는다⁵. Petroff-Hausser 챔버는 대체 방법론이지만 이를 수행하려면 숙련된 현미경 전문가가 필요합니다. 유세포 분석은 이러한 목적을 위한 유용한 대안임이 입증되었습니다.

Genovese et ^al.12 는 두 개의 핵산 마커를 사용하여 Bacillus sp.의 생존 세포 및 포자를 정량화하기 위한 유세포 분석의 사용과 구성할 수치량을 결정하는 옵션을 제공하는 장비의 유속(부피/분)의 높은 제어 용량을 설명했습니다. 모든 유세포 분석 장비가 유속(부피/분)을 엄격하게 제어하는 것은 아니며 일부는 최소, 중간 및 최대 옵션으로만 조정할 수 있습니다. 이러한 경우 계수 비드를 사용하여 세포 계수의 정확성과 다른 유세포 분석 장비에 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
(N-하이드록시숙신이미드) (NHS)	Sigma	130672
항인간 형광 항체	BioLegend	501410	APC 항인간 IL-10
항마우스 형광 항체	Thermo Scientific	A32723	Alexa Fluor Plus 488
BD FACSCanto II			유세포분석기
BD FACSDiva 세포분석기 설정 및 추적 비드 키트(BD FACSDiva 소프트웨어 v 6.x와 함께 사용)	BD	642412	품질 관리 시약
BD FACSDiva 소프트웨어 v. 6.1.3	BD	643629	소프트웨어
원심분리기 MegaFuge 8R	Thermo Scientific	75007213
카운팅 비드	BD	340334	TruCount 튜브
Eclipse 80i	Nikon		형광 마이크로소프
에티듐 브로마이드	Ludwig Biotec
인산염 완충 식염수	Sigma-Aldrich	A4503
플라스틱 마이크로튜브	Eppendorf
폴리스티렌 튜브	Falcon	352008	5 mL 폴리스티렌 튜브, 12 x 75 mm, 뚜껑 없음, 비멸균