Method Article

나노디스크를 함유하는 생리활성제의 제형 및 특성화

DOI:

10.3791/65145

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March 17th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 나노디스크를 포함하는 생리활성제의 생산 및 특성화에 대해 설명합니다. 암포테리신 B 나노디스크는 프로토콜을 단계적으로 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

Abstract

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나노디스크라는 용어는 이중층 형성 지질, 스캐폴드 단백질 및 통합 생리활성제로 구성된 개별 유형의 나노입자를 의미합니다. 나노 디스크는 디스크 모양의 지질 이중층으로 구성되며, 그 둘레는 스캐 폴드 단백질, 일반적으로 교환 가능한 아포지 단백질 계열의 구성원으로 둘러싸여 있습니다. 수많은 소수성 생리활성제는 입자의 지질 이중층의 소수성 환경에 통합되어 나노디스크에서 효율적으로 용해되어 직경 10-20nm 범위의 대체로 균질한 입자 집단을 생성합니다. 나노 디스크의 제형은 개별 성분의 정확한 비율, 각 성분의 적절한 순차적 첨가, 제형 혼합물의 목욕 초음파 처리가 필요합니다. 양친매성 스캐폴드 단백질은 분산된 이중층 형성 지질/생리활성제 혼합물을 자발적으로 접촉하고 재구성하여 나노디스크 입자의 분리되고 균질한 집단을 형성합니다. 이 과정에서 반응 혼합물은 불투명하고 탁한 모양에서 완전히 최적화되면 원심분리 시 침전물이 생성되지 않는 정제된 샘플로 전환됩니다. 특성화 연구에는 생리활성제 가용화 효율, 전자 현미경, 겔 여과 크로마토그래피, 자외선 가시광선(UV/Vis) 흡광도 분광법 및/또는 형광 분광법의 측정이 포함됩니다. 이것은 일반적으로 배양 된 세포 또는 마우스를 사용하여 생물학적 활성을 조사합니다. 항생제(즉, 마크로라이드 폴리엔 항생제 암포테리신 B)를 함유하는 나노디스크의 경우, 농도 또는 시간의 함수로서 효모 또는 진균의 성장을 억제하는 능력을 측정할 수 있습니다. 제형의 상대적 용이성, 구성 부품에 대한 다양성, 나노 스케일 입자 크기, 고유 안정성 및 수용성은 나노 디스크 기술의 무수한 시험관 내 및 생체 내 응용을 허용합니다. 본 논문에서, 우리는 소수성 생리활성제로서 암포테리신 B를 함유하는 나노디스크를 공식화하고 특성화하는 일반적인 방법론을 설명한다.

Introduction

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초기 원반형 고밀도 지단백질(HDL)은 인간 순환계에 존재하는 훨씬 더 풍부한 구형 HDL의 자연 발생 전구체입니다. pre-ß HDL이라고도 하는 이러한 초기 입자는 독특하고 독특한 구조적 특성을 가지고 있습니다1. 실제로, 초기 HDL은 구상 입자로 존재하는 것이 아니라 디스크 모양입니다. 자연 및 재구성 원반형 HDL에 대한 광범위한 구조적 특성화 연구는 주변이 apoA-I와 같은 양친매성 교환 가능한 아포지단백(apo)으로 둘러싸인 인지질 이중층으로 구성되어 있음을 밝혔습니다. 인간 지단백질 대사에서 순환하는 초기 HDL은 말초 세포에서 지질을 축적하고 ATP 결합 카세트 수송체 A1 및 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼제2를 포함한 주요 단백질 매개체에 의존하는 과정에서 구형 HDL로 성숙합니다. 이 과정은 심장 질환을 예방하는 것으로 간주되는 역 콜레스테롤 수송 경로의 중요한 구성 요소를 나타냅니다. 이러한 지식과 원반형 HDL을 재구성할 수 있는 능력으로 무장한 연구자들은 이러한 입자를 죽상동맥경화증을 치료하기 위한 치료적 중재로 사용했다3. 본질적으로, 환자에게 재구성 된 HDL (rHDL)을 주입하면 플라크 침전물에서 콜레스테롤 유출을 촉진하고 담즙산으....

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Protocol

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1. 스캐폴드 단백질 성분의 형질전환, 발현 및 정제

  1. 플라스미드를 함유하는 apoE4-NT를 이용한 BL21 박테리아 형질전환
    1. BL21(DE3) 유능한 세포 튜브를 얼음 위에서 10분 동안 해동합니다.
    2. 모든 얼음이 녹으면 50μL의 세포를 얼음 위의 형질 전환 튜브에 부드럽고 조심스럽게 피펫으로 혼합합니다.
    3. 50ng의 플라스미드 DNA를 함유하는 5μL(서열은 보충 표 1 참조)를 세포 혼합물에 추가합니다. 튜브를 조심스럽게 4-5번 튕겨 섞습니다. 소용돌이치지 마십시오.
    4. 혼합물을 얼음 위에 30분 동안 놓습니다.
    5. 혼합물을 정확히 42°C에서 10초 동안 열 충격을 가합니다.
    6. 얼음 위에 5분 동안 둡니다.
    7. 950 μL의 S.O.C. 배지를 실온에서 튜브에 넣습니다.
    8. 튜브를 37°C 진탕 인큐베이터에 넣고 진동을 250rpm으로 설정하여 60분 동안 배치합니다.
    9. 플릭 및 반전으로 세포를 완전히 혼합한 다음 100μL의 세포 용액을 0.1mg/mL 농도의 암피실린으로 처리된 20mL Luria Broth + Agar 선택 플레이트에 뿌립니다.
      10. ....

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Results

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생리활성제 나노디스크 제형 공정
설명된 ampB-나노디스크 제형 절차에서 시료 외관이 탁한 상태에서 투명한 상태로 전환되면 반응이 완료된 것으로 간주됩니다(그림 1). 이 변화는 나노 디스크가 형성되고 생리 활성제가 가용화되었음을 나타냅니다. 종종 생리활성제는 가시광선 파장 영역(예: ampB, 커큐민, 루테인, 코엔자임 Q10)의 빛을 흡수하며, 이러한 경우 샘플은 생리활성제의 색상을 채택합니다. 샘플 정화가 완료되면 (보통 5-20 분의 목욕 초음파 처리), 샘플을 1.7 ml 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기고 11,000 x g 에서 5 분 동안 원심 분리하여 불용성 물질을 펠렛으로 만듭니다. 눈에 보이는 펠릿이 없다는 것은 생리활성제가 나노디스크에 혼입되었다는 강력한 증거로 간주될 수 있습니다. 반면에, 펠릿의 외관은 부분적으로 또는 전혀 생리활성제 혼입이 발생하지 않았음을 나타낸다. 필요하거나 .......

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Discussion

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나노디스크를 함유하는 생리활성제의 제형은 달리 불용성인 소수성 화합물을 가용화하는 편리한 방법을 제공한다. 생성물 생리활성제 나노디스크는 수성 매질에 완전히 용해되기 때문에 광범위한 소수성 분자에 대한 유용한 전달 방법을 제공합니다(표 1). 여기에는 소분자, 천연 및 합성 약물, 식물 영양소, 호르몬 등이 포함됩니다. 제형 전략은 일반적으로 유기 용매에서 생리 활성제의 용해도 특성을 고려해야 하는 표준 프로토콜을 따릅니다. 생리활성제를 용해하기 위해 적절한 유기 용매를 선택하는 것 외에도 ~20mg/ml 원액 및 용매와 수용액의 혼화성을 달성하는 두 가지 추가 매개변수가 필요합니다. 이는 과량의 유기 용매를 도입하지 않으면서 상당한 양의 생리활성제가 제형 혼합물에 첨가될 수 있도록 하기 때문에 필요하다. 상분리는 생리활성제가 제품 나노디스크로 혼입되는 것을 방지하기 때문에 혼화성이 중요합니다.

이중층 형성 인지질 분산액을 선택한 직후에 생체활성제를.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health) (R37 HL-64159)의 보조금으로 지원되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BCayman Chemical Company11636ND 제형 및 표준물질 제제
AmpicillinFisher ScientificBP17925Transformation & 확장팩
ApoE4-NT PlasmidGenScriptN/A변환
당황한 플라스크뉴브런즈윅 사이언티픽N/A확장 & 발현
BL21 유능한 대장균New England BiolabsC2527I형질 전환
원심분리기 병Nalgene3140-0250발현
클로로포름Fisher ScientificG607-4ND 제형
DMSO시그마 Aldrich472301표준 분만
DymyristoylphosphatidylcholineAvanti Lipids850345PND 제형
삼각 플라스크Bellco 생명 공학N/A확장 및 표현
팔콘 튜브Sarstedt Ag & CoD51588효모 생존력 분석
유리 붕규산 튜브VWR47729-570ND 제형
GraphPad (소프트웨어)DotmaticsN/A효모 생존력 분석
가열 초음파 처리 수조VWRN/AND Formulaton
가열 및 질소 모듈Thermo ScientificTS-18822ND 제형
HiTrap 헤파린 HP (5 mL)GE 헬스케어17-0407-03정제
이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노사이드 Fisher ScientificBP1755Expression
J-25 CentrifugeBeckman CoulterJ325-IM-2Expression
JA-14Rotor Beckman Coulter339247Expression
LyophilizerLabconco7755030ND Formulation
MethanolFisher ScientificA452-4ND Formulation
Nitrogen gasPraxairUN1066ND 제형
NZCYM 미디어RPI 연구 제품N7200-1000.0확장 및 표현식
Pet-22B 벡터GenScriptN/A변환
페트리 접시Fisher ScientificFB0875718변환 & 확장
석영 큐벳Fisher Brand14385 928A스펙트럼 분석
쉐이킹 인큐베이터New Brunswick ScientificM1344-0004변환, 확장 및 Expression
Slide-A-Lyzer 부표Thermo Scientific66430정제
SnakeSkin 투석 튜빙Thermo Scientific68100정제
SnakeSkin 투석 튜빙Thermo Scientific88243정제
염화나트륨Fisher ScientificS271정제
인산나트륨 이염기성Fisher ScientificS374-500정제
인산나트륨 일염기성 Fisher ScientificBP329-500정제
스펙트럼/POR 가중 폐쇄스펙트럼 의료 산업132736정화
분광 광도계Shimadzu UV-1800220-92961-01스펙트럼 분석
탁상용 원심분리기Beckman Coulter366816ND 제형
UVProbe 2.61 (소프트웨어)ShimadzuN/A분광 분석
진공 필터Millipore9004-70-0Expression & 정화
진공 펌프GAST Manufacturing IncDOA-P704-AAExpression & 정화
Vortex Fisher Scientific12-812ND 제형
효모N/ABY4741효모 생존력 분석
효모 추출물-펩톤-포도당BD242820효모 생존력 분석

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025(2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A.

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