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방법 논문

Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

8K 조회수

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DOI:

10.3791/65151

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2023년 3월 31일

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1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, College of Pharmacy, Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacy, The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University, 3The School of Preclinical Medicine, Chengdu University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서 우리는 비침습적 구인두 기관내 삽관을 통한 기관내 지질다당류(LPS) 전달을 위한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 동물에 대한 수술 절차의 외상을 최소화하고 LPS를 기관으로 정확하게 전달한 다음 폐로 전달합니다.

초록

지질다당류(LPS) 또는 내독소에 의해 유도된 급성 폐 손상(ALI) 마우스 모델은 여전히 급성 폐 손상 또는 급성 염증에 대한 동물 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 모델 중 하나입니다. 급성 폐 손상 마우스 모델에서 현재 가장 일반적으로 사용되는 방법은 LPS의 복강내 주사 및 LPS의 기관 주입을 위한 기관 절개술이다. 그러나 전자의 방법은 폐 표적이 부족하고 다른 장기를 손상시키며, 후자의 방법은 수술적 외상, 감염 위험 및 낮은 생존율을 유발합니다. 여기서는 생쥐에 LPS 점적을 위한 비침습적 구인두 기관내 삽관 방법을 권장합니다. 이 방법에서, LPS는 구강 인두강을 통해 비 침습적으로 기관 내로 도입되어 기관 내 삽관을위한 장치의 도움으로 폐에 주입된다. 이 방법은 폐 표적화를 보장할 뿐만 아니라 동물의 손상 및 사망 위험을 방지합니다. 우리는 이 접근법이 급성 폐 손상 분야에서 널리 사용될 것으로 기대합니다.

서론

급성 폐 손상(ALI)은 흔한 임상 증후군입니다. 다양한 병원성 요인 하에서 폐 상피 세포와 혈관 내피 세포의 생리적 장벽이 파괴되면 폐포 투과성이 증가하여 폐 순응도 감소, 폐부종 및 중증 저산소혈증을 유발합니다1. 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 ALI의 가장 심각한 형태입니다. 조절되지 않는 염증 및 산화 스트레스 손상은 ALI와 더 심각한 ARDS2의 주요 원인으로 간주됩니다. 외상으로 인해 폐포 상피세포가 직접 손상되면 폐포 대식세포의 염증 반응 사슬이 활성화되어 폐에 염증을 일으킨다3. 전 세계적으로 연간 300만 명 이상의 급성 ARDS 환자가 있으며 중환자실 입원의 약 10%를 차지합니다. 또한 중증의 경우 사망률은 46%4,5,6에 달합니다. 따라서 ALI의 발병기전을 연구하기 위해 적합한 ALI 동물모델을 확립할 필요가 있다. 마우스는 ALI 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 실험 동물로, 호흡기가 ALI 연구를 위해 인간의 호흡기를 잘 시뮬레이션할 수 있기 때문입니다. 또한 ALI는 대규모 염증 세포 침윤, 폐혈관 투과성 증가 및 폐부종으로 나타납니다. 혈청 내 염증성 사이토카인의 변화와 폐 건습식 중량비는 ALI7의 정도를 반영한다.

현재, 마우스에서 LPS 유도 ALI를 모델링하는 주요 방법은 비강내 및 외과적 기관 삽관을 포함한다8,9. 여기에서 우리는 비침습적 구인두 삽관을 통해 LPS를 기관으로 전달하는 새로운 방법을 제안합니다. 이 방법은 조명 삽관기를 사용하여 마우스의 기관을 찾은 다음 LPS를 기관과 폐로 전달합니다. 이 방법은 비강 내 전달 방법보다 더 정확하게 LPS를 폐에 전달합니다. 외과적 기관 삽관과 비교하여, 이 방법은 수술을 필요로 하지 않고, 상처를 유발하는 것을 피하며, 생쥐의 통증을 감소시킨다10. 따라서 이 방법을 사용하여 보다 설득력 있는 ALI 마우스 모델을 구축할 수 있습니다.

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프로토콜

동물 실험 프로토콜은 청두 한의과대학 경영위원회(기록 번호 2021-11)에서 검토 및 승인되었습니다. 수컷 C57/BL 마우스(20-25g, 6-8주령)를 본 연구에 사용하였다. 마우스는 동물 챔버에 보관되었고 실험 중에 자유롭게 마시고 먹을 수 있었습니다.

1. 준비

  1. 삽관 플랫폼이 받침대, 라이저, 종이 클립, 두 개의 고무 밴드 및 일부 끈으로 구성되어 있는지 확인하십시오. 끈을 잡고 라이저 상단의 두 구멍을 통해 끈을 통과시키고 끈의 두 끝을 라이저 상단의 작은 돌출부에 각각 묶습니다.
    알림: 마우스의 머리가 끈과 두 구멍 사이를 통과할 수 있도록 공간을 남겨 두십시오.
  2. 종이 클립의 양쪽 끝에 두 개의 고무 밴드를 묶고 고무 밴드로 종이 클립을 라이저 뒷면에 테이프로 붙입니다. 마지막으로 라이저를 베이스에 90°로 고정합니다(그림 1).
  3. 적절한 크기와 길이의 캐뉼라를 선택하십시오. 20-30g 마우스의 경우 22G 카테터(길이 2.5-3.8cm)를 사용할 수 있습니다11. 캐뉼라를 캐뉼라 펜에 조립하고 펜의 표시등을 켭니다(그림 2).
  4. 작은 수술용 집게와 파스퇴르 피펫을 70% 알코올로 소독하여 준비합니다.

2. 시험 화합물의 제조

  1. LPS 3mg을 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.2) 1mL에 무게를 달아 용해시켜 3mg/mL 농도의 LPS 용액을 형성합니다.
  2. 펜토바르비탈 나트륨 10mg을 생리식염수 1mL에 칭량하여 용해시켜 1% 펜토바르비탈 나트륨 용액을 만듭니다. 0.45μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 필터 멸균합니다.

3. 비침습적 구인두 점적

  1. 50 mg/kg의 용량으로 1% 펜토바르비탈 나트륨을 복강내 주사하여 마우스를 마취시킨다12,13. 정정 반사에 대한 반응의 부족으로 마취의 깊이를 결정하십시오.
  2. 마취된 마우스를 삽관 플랫폼에 놓습니다. 위쪽 앞니는 실로 고정하고 앞발 두 개는 고무줄로 고정합니다(그림 3).
  3. 핀셋으로 혀를 당겨 왼손으로 잡습니다. 캐뉼라를 입을 따라 오른손을 위로 올려 하악 후두개까지 천천히 밉니다. 캐뉼라 펜의 빛을 사용하여 기관을 찾아 천천히 기관에 삽입합니다(그림 4).
  4. 캐뉼라를 기관에 삽입한 후 삽관 펜을 천천히 빼내고 캐뉼라를 안에 둡니다. 파스퇴르 피펫을 캐뉼라 조인트에 삽입하고 헤드를 누릅니다(그림 5).
    참고: 마우스의 가슴이 부풀어 오르면 삽관이 성공한 것입니다(그림 6).
  5. 성공적인 기관내 삽관 후, 납작한 머리 미세 주사기를 사용하여 캐뉼라를 통해 3 mg/kg의 3 mg/mL LPS를 마우스에 주입합니다14,15 (그림 7).
  6. 완료되면 캐뉼라와 미세 주사기를 제거합니다. 스캐폴드에서 마우스를 제거하고 별도로 케이지에 넣어 복구합니다. 마우스가 회복되고 의식을 회복 할 때까지 마우스의 호흡 상태를 관찰하십시오.
    참고: LPS 기관 점적 후 12시간에 동물 윤리 위원회에서 승인한 절차에 따라 마우스를 안락사시킵니다. 혈청 TNF-α 분석 및 건식-습식 폐 중량 측정은 표준 절차를 사용하여 수행하였다.

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결과

마우스에 LPS 점적을 위해 제안된 방법은 LPS 점적 후 12시간 후에 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현과 폐건습윤 중량비를 평가하여 검증하였다. 실험에는 4개의 그룹이 있었다: 블랭크 대조군(치료 없음), 외과적 삽관 16, 비강내 삽관17,18 및 비침습적 구인두삽관(n = 6). 블랭크 대조군과 비교하여, 비침습성 구인두 삽관군에서 혈청 TNF-α 수치가 유의하게 증가하였다(도 8A). 폐 건식-습식 중량 비율도 증가하여(그림 8B), 외과적 기관 삽관 그룹과 동일한 수준에 도달했습니다. 데이터 세트는 짝을 이루지 않은 ANOVA와 사후 다중 비교 Tukey Kramer 테스트를 사용하여 통계적으로 분석되었습...

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토론

처음에는 기관19의 위치를 찾기 위해 구강 내부를 조사했습니다. 그러나, 이 과정 동안, C57/BL 마우스의 기관이 좁아서, 내시경(20)과 같은 장비의 도움 없이는 이 방법으로 정확한 위치를 찾기가 어렵다는 것을 발견하였다. 추가 탐사를 통해 삽관 램프의 빛이 신체 표면을 관통하여 작업자가 캐뉼라(21)의 위치를 결정할 수 있음을 발견했습니다.

튜브가 기관에 들어 갔는지 확인하기 위해 처음에는 작은 거울을 사용하여 얼음 위에 올려 놓아 식혔습니다. 삽관 후 거울을 사용하여 캐뉼라 입구에 접근했습니다. 거울에 안개가 나타나면 삽관이 성공한 것으로 간주됩니다. 그러나 이 검사 방법으로는 캐뉼라가 기관에 들어갔는지 여부를 정확하게 판단할 수 없다는 것을 발견했습니다. 첫째, 캐뉼라 헤드가 마우스의 입에 가까웠고, 거울에 나타난 안개가 입에서 내뿜는 가스로...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (No.: 81903902), 중국 박사후 과학 재단 (No.: 2019M663457), 쓰촨 과학 기술 프로그램 (No.: 2020YJ0172) 및 청두 중의학 대학의 Xinglin Scholar Research Premotion Project(No.: QJRC2022053)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
LipopolysaccharideMERKL4130LPS
마이크로리터 주사기SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD10028505008124 LPS
마우스 캐뉼라RWD Life Science803-03008-00마우스 캐뉼라
마우스 삽관 키트RWD Life Science903-03027-00베이스, 라이저, 삽관기, 수술용 겸자 및 일부를 포함합니다. 끈
파스퇴르 피펫Biosharp 생명 과학BS-XG-03삽관
펜토바르비탈 나트륨베이징 화학 유한 20220918쥐를 마취하기 위해

참고문헌

  1. Xia, Y., et al. Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).
  2. Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
  3. Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).
  4. Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: Advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
  5. Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S. Acute respiratory distress syndrome. Lancet. 398 (10300), 622-637 (2021).
  6. An, N., Yang, T., Zhang, X. X., Xu, M. X. Bergamottin alleviates LPS-induced acute lung injury by inducing SIRT1 and suppressing NF-κB. Innate Immunity. 27 (7-8), 543-552 (2021).
  7. Liu, L., et al. Comparative study of trans-oral and trans-tracheal intratracheal instillations in a murine model of acute lung injury. The Anatomical Record. 295 (9), 1513-1519 (2012).
  8. Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581(2011).
  9. Li, J., et al. Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 96(2021).
  10. Zhou, Y., et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitor attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury and improves survival in mice. Shock. 47 (5), 638-645 (2017).
  11. Nosaka, N., et al. Optimal tube length of orotracheal intubation for mice. Laboratory Animals. 53 (1), 79-83 (2019).
  12. Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).
  13. Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59999(2019).
  14. Yang, H., et al. STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway. Cell Death & Disease. 13 (6), 530(2022).
  15. Aramaki, O., et al. Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).
  16. Lan, W. Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI). Peking Union Medical College. , PhD Thesis (2010).
  17. Lv, H., et al. Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-κB and MAPK signalling pathways. Respiratory Physiology & Neurobiology. 216, 43-51 (2015).
  18. Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-κB pathways. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62(2019).
  19. Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).
  20. Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
  21. Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C. Repeated orotracheal intubation in mice. Journal of Visualized Experiments. (157), e60844(2020).
  22. Zhang, S., et al. Microvesicles packaging IL-1β and TNF-α enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling. International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).
  23. Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. Jilin University. , Master's Thesis (2010).
  24. Chen, J. H., et al. Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).
  25. Luckow, B., Lehmann, M. H. A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy. BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).
  26. Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601(2013).

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