본 프로토콜은 새로운 나노에멀젼 보조제 백신의 물리적 특성, 면역 반응 및 생체 내 보호 효과를 준비하고 평가합니다.
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이 논문에서
요약
초록
나노 에멀젼 보조 백신은 작은 입자 크기, 높은 열 안정성 및 유효한 면역 반응을 유도하는 능력으로 인해 광범위한 관심을 끌었습니다. 그러나 새로운 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응을 평가하기 위한 일련의 포괄적인 프로토콜을 수립하는 것이 중요합니다. 따라서 이 기사에서는 백신의 물리화학적 특성(투과전자현미경[TEM], 원자력현미경[AFM] 및 동적 광산란[DLS]), 백신 항원 및 시스템의 안정성(고속 원심분리기 테스트, 열역학적 안정성 테스트, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯) 및 특정 면역 반응(IgG1, IgG2a 및 IgG2b). 이 접근법을 사용하여 연구자들은 치명적인 MRSA252 마우스 모델에서 새로운 나노 에멀젼 보조 백신의 보호 효과를 정확하게 평가할 수 있습니다. 이러한 프로토콜을 통해 효과적인 보조제 잠재력 측면에서 가장 유망한 나노에멀젼 백신 보조제를 확인할 수 있습니다. 또한 이 방법은 향후 개발을 위해 새로운 백신을 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
서론
메티실린 내성 황색포도 상구균 (MRSA)은 전 세계 중환자실(ICU) 병동1, 심장내과 및 화상 부서에서 감염률이 가장 높은 기회 병원체 중 하나입니다. MRSA는 높은 감염률, 사망률 및 광범위한 약물 내성을 나타내어 임상 치료에 큰 어려움을 나타냅니다2. 2017년 세계보건기구(WHO)가 발표한 항생제 내성 박테리아의 글로벌 우선순위 목록에서 MRSA는 가장 중요한 범주3에 포함되었습니다. 따라서 MRSA 감염에 대한 백신이 시급히 필요합니다.
알루미늄 보조제는 오랫동안 사용되어 왔으며 보조제 보조 메커니즘은 비교적 명확하고 안전하며 효과적이며 내약성이 우수합니다4. 알루미늄 보조제는 현재 널리 사용되는 보조제 유형입니다. 일반적으로 알루미늄염 입자에 흡착된 항원은 안정성을 향상시키고 주사 부위의 항원 흡수 능력을 향상시켜 우수한 흡수와 느린 방출을 제공할 수 있다고 믿어진다5. 현재, 알루미늄 보조제의 주요 단점은 일부 백신 후보 항원에 대해 보조제 효과가 없거나 약한 보조제 효과만을 나타낸다는 것이다
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프로토콜
동물실험은 실험동물의 사용과 관리에 관한 매뉴얼에 의거하여 실시하였으며, 제3군의과대학 실험동물복지윤리위원회의 승인을 받았다. 6-8주령의 암컷 Balb/c 마우스를 본 연구에 사용했습니다. 동물들은 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료 표 참조).
1. MRSA HI 항원 단백질의 제조
- 상업적 소스에서 IsdB 및 Hla 클론을 얻고(재료 표 참조), 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 수행하여 IsdB 및 Hla 유전자를 증폭하고, 해당 제품을 PGEX-6P-2 플라스미드에 결찰합니다(상업적으로 얻음, 재료 표 참조). 대장균10의 벡터 Xl/blue 균주로 스크리닝합니다.
- 양성 클론을 대장균 BL21 적격 세포로 형질전환하고( 재료 표 참조) 상어 배양으로 증폭한다10.
- 이소프로필-β-D-1-메르캅토갈락토피라노사이드 및 다중 모드 크로마토그래피(MMC....
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결과
나노에멀젼 아쥬반트 백신을 제조하기 위한 프로토콜과 이 백신의 시험관내 및 생체내 시험이 평가되었다. TEM, AFM 및 DLS를 사용하여 이 샘플 표면의 제타 전위 및 입자 크기의 중요한 특성을 확인했습니다(그림 1). SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅은 침전물 및 상청액 내의 항원의 양이 원심분리 후에도 유의하게 분해되지 않았음을 보여주었으며, 이는 백신이 구조적으로 손상되지 않고 특이적이며 면역원성임을 나타냅니다(그림 2). 나노에멀젼 보조제 백신은 총 IgG, IgG1 및 IgG 2a 항체 역가를 유의하게 증가시켰다. 백신의 면역원성은 상당히 개선되었다(도 3A-C). 항원 그룹의 450 nm에서 혈청 IgG2b OD 값이 가장 높았다 (1:500 PBS에서 희석) (
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토론
박테리아 세포벽 고정 및 철 조절 표면 단백질인 IsdB는 헴철15를 얻는 과정에서 중요한 역할을 합니다. 알파 독소인 HLA는 MRSA에서 알려진 가장 효과적인 박테리아 독소 중 하나이며, 진핵 세포에 기공을 형성하고 부착 및 상피 세포를 방해할 수 있다16. 본 연구에서는 IsdB와 Hla의 항원 유전자를 기반으로 한 유전자 공학 기술로 새로운 재조합 MRSA 항원 단백질(HI)을 구성하고 발현했습니다. 이어서, 저에너지 유화법에 의해 나노에멀젼 백신을 개발하고, 이 백신의 안정성 및 유효성을 평가하였다. 예를 들어, 생체 내에서의 장기 안정성, 구조, 형상, 흡수 및 효과와 같은 일부 특성은 에멀젼 액적(7)의 크기에 의해 크게 영향을 받는다. 결과는 입자 크기가 생체 내에서 나노에멀젼의 수송과 항원 .......
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공개 사항
저자는 이 작업에 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램 No. 2021YFC2302603, NSFC No. 32070924 및 32000651, 충칭 자연 과학 재단 프로젝트 프로그램의 No. 2019jcyjA-msxmx0159의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5424-소형 고속 원심분리기FA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | ||
| 96웰 플레이트 | Corning Incorporated, 미국 | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, 독일 | null | |
| 알코올 램프 | Shenzhen Yibaxun Technology Co., China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c 마우스 | 베이징 HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP / NBT | 푸저우 Maixin 생명 공학 개발 회사, 중국 | BCIP / NBT | |
| Bio-Rad 6.0 마이크로 플레이트 리더 | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 유능한 세포 | Merck millipore, 독일 | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, 미국 | B2064-100G | |
| 원심 분리기 5810 R | 에펜도르프, 독일 | ||
| Coomassie 밝은 파란색 G-250 염색 용액 | MIKX, 중국 | DB236 | |
| 탈색 용액 | BOSTER, 중국 | AR0163-2 | |
| 전기 가열 서 온도 경운기 HH-B11-420 | 상하이 Yuejin 의료 기기 공장, 중국 | null | |
| 전기 영동 장치 | 베이징 Liuyi 악기 공장, 중국 | DYCZ-25D | |
| 젤 이미지 | Tanon, 미국 | null | |
| 글루타티온-세파로스 수지 GST | Mei5bio, 중국 | 친화 크로마토그래피 수지 | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD, 중국 | 7664-93-9 | |
| 안녕 재조합 단백질 | 제 3 군사 의과 대학, 중국 | 110-27-0 | |
| HRP - 염소 안티 마우스 IgG | Biodragon, 중국 | BF03001 | |
| HRP- 염소 안티 마우스 IgG1 | Biodragon, 중국 | BF03002R | |
| HRP - 염소 안티 마우스 IgG2a | Biodragon, 중국 | BF03003R | |
| HRP- 염소 안티 마우스 IgG2b | Biodragon, 중국 | BF03004R | |
| 접종 루프 | Haimen Feiyue Co., LTD, 중국 | YR-JZH-1UL | |
| IsdB 및 Hla 클론 | 상하이 Jereh 생명 공학 공동, 중국 | null | |
| 이소 프로필 육두구 (제약 보조제) | SEPPIC, 프랑스 | null | |
| 이소 프로필-β -D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio, 중국 | FD3278-1 | |
| LB 부용 배양 매체 | 베이징 AOBOX 생명 공학 유한 회사, 중국 | 02-136 | |
| 적외선 물리 치료 램프 | Guangzhou Runman Medical Equipment Co., China | 7600 | |
| 저온 냉장 원심분리기 | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., 영국 | null | |
| MH(A) 매체 | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) 매체 | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park, USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co., LTD, China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH (SHANGHAI) CO., LTD | ||
| 0022818 MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop 자외선 분광 광도계 | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE 단백질 전기 영동 젤 키트 | DAKEWE, 중국 | 8012011 | |
| PBS | biosharp, 중국 | null | |
| PCR, 증폭기 | 열 순환기, 미국 | null | |
| pGEX 타겟 유전자 재조합 플라스미드 | 상하이 Jereh 생명 공학 공동, 중국 | B3528G | |
| 포스 포 텅스텐 산 | G-CLONE, 중국 | CS1231-25g | |
| 피펫 | 에펜도르프, 독일 | ||
| 폴리옥시에틸화 피마자유(약제 보조제) | 알라딘, 중국 | K400327-1kg | |
| 1차 항체 | 실험실 홈메이드: 양성 혈청 null을 가진 면역된 마우스에서 | 참조 11 참조 참조 | |
| 렌 글리콜(제약 보조제) | Sigma-Aldrich, 미국 | P4347-500ML | |
| 단백질 마커 | Thermo Scientufuc, 미국 | 26616 | |
| PVDF 전사막 | Invitrogen, 미국 | 88518 | |
| 주사 전자 현미경 | JEOL, 일본 | JSM-IT800 | |
| 나트륨 펜토바르비탈 | Merck, 독일 | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, 미국 | null | |
| TMB 컬러 솔루션 | TIAN GEN, 중국 | PA107-01 | |
| 거북이 키트 | Xiamen Bioendo Technology Co., LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
참고문헌
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epide....
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재인쇄 및 허가
