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방법 논문

Micro-CT 영상 및 생쥐 신생아 뇌의 형태 분석

2.9K 조회수

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DOI:

10.3791/65180

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2023년 5월 19일

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1Unidad Ejecutora de Estudios en Neurociencias y Sistemas Complejos (ENyS, CONICET-UNAJ-HEC), 2Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de La Plata, 3Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 4Department of Cell Biology and Anatomy, Cumming School of Medicine, University of Calgary

이 논문에서

요약

이 연구는 생체 외 샘플에서 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT)과 조영제를 결합하여 신생아 마우스 뇌의 고해상도 이미지를 얻는 단계를 설명합니다. 우리는 이러한 이미지에서 뇌 크기와 모양을 정량화하기 위한 기본 형태 분석을 설명합니다.

초록

신경 영상은 동물 모델을 사용한 실험에서 뇌 형태를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 자기공명영상(MRI)은 연조직의 표준 방법이 되었지만, 공간 해상도가 낮아 작은 동물에게는 한계가 있습니다. 여기서는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT)을 사용하여 생쥐 신생아 뇌 및 두개골에 대한 고해상도 3차원(3D) 정보를 얻기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 샘플을 해부하고, 뇌를 염색 및 스캔하고, 전체 장기 및 관심 영역(ROI)의 형태 측정 측정값을 얻는 데 필요한 단계가 포함됩니다. 이미지 분석에는 구조의 분할과 점 좌표의 디지털화가 포함됩니다. 요컨대, 이 연구는 조영제로서 마이크로 CT와 Lugol의 용액을 조합하는 것이 작은 동물의 주산기 뇌를 이미징하는 데 적합한 대안임을 보여줍니다. 이 이미징 워크플로우는 발달 생물학, 생물의학 및 다양한 유전적 및 환경적 요인이 뇌 발달에 미치는 영향을 평가하는 데 관심이 있는 기타 과학에 적용됩니다.

서론

마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT) 영상은 다양한 연구 분야에 유용한 도구입니다. 생물학에서는 광물화 된 조직의 X 선 흡수로 인해 뼈 연구에 특히 적합합니다. 이러한 특성으로 인해, 뼈 발달(bone development)1, 신진대사(metabolism)2, 진화(evolution)3,4 등에 관한 다양한 질문들이 micro-CT의 도움을 받아 접근되었다. 2008년 de Crespigny 등은 요오드를 조영제로 사용하여 성체 쥐와 토끼 뇌의 마이크로 CT 이미지를 얻을 수 있음을 보여주었습니다. 이 작업은 요오드가 X선에 둔감한 연조직으로부터 이미지를 획득할 수 있게 해주었기 때문에 이 이미징 기술에 대한 새로운 응용 프로그램을 열었습니다. 따라서 마이크로 CT와 요오드 기반 조영제를 결합하는 일반적인 목표는 중조직 또는 거시 해부학적 수준에서 연조직을 구별하고 식별할 수 있는 고해상도 이미지를 얻는 것입니다.

이 기술은 실험 설계에 널리 사용되는 마우스 배아와 같은 작은 표본의 상세한 생체 외 표현형 특성 분석이 필요한 연구에 주목할 만한 잠재력을 가지고 있습니다6. 요오드 조영제와 마이크로 CT 영상은 장기7 및 획기적인 3차원(3D) 구조8,9의 체적 정량화를 얻는 데 사용되었다. 최근 몇 년 동안, 염색된 샘플의 마이크로 CT 스캐닝은 설치류(10)의 뇌 표현형 특징을 설명하기 위해 적용되었으며, 기술에 대한 다양한 개선이 제안되었다. 성인의 뇌의 경우, 하이드로겔을 사용한 관류의 이전 단계와 함께 요오드에 48시간 동안 담그는 프로토콜이 고품질11의 이미지를 생성하는 것으로 밝혀졌습니다. Gignac et al.[12]은 요오드로 염색된 쥐의 뇌를 처리하여 일상적인 조직학적 기술을 수행할 수 있음을 보여줌으로써 이 기술의 한계를 확장했습니다. 유사하게, 이러한 절차는 배아 및 젖을 떼기 전 설치류의 뇌에 대한 유망한 결과를 보여줍니다 8,13,14,15.

신경 과학은 뇌 발달의 다양한 구조적, 기능적 측면을 평가하기 위해 현미경 기반 기술을 주로 적용했지만 이러한 연구는 특정 세포 집단 또는 공간적으로 제한된 구조를 특성화하는 데 더 적합합니다. 반대로, 마이크로 CT 이미징을 사용하면 전체 구조를 설명하고 관련 공간 정보를 보존하는 3D 모델을 획득할 수 있어 현미경 기술을 보완할 수 있습니다. 자기공명영상(MRI)은 또한 작은 동물의 구조적 특징을 탐구하기 위해 적용되는 표준 기술이다 16,17,18. 그러나 조영제를 사용하는 마이크로 CT는 생체 외 고정 샘플에 대한 두 가지 주요 이점이 있습니다: 마이크로 CT 스캐너는 대체로 저렴하고 작동하기 쉬우며 MRI12보다 더 높은 공간 해상도를 허용합니다.

이 연구는 요오드 기반 조영제인 Lugol's solution으로 염색한 후 마이크로 CT 스캔을 사용하여 신생아 쥐의 뇌에서 고해상도 이미지를 얻는 절차를 설명하는 것을 목표로 합니다. 샘플 수집 및 조직 고정과 같은 예비 단계에서 시작하여 염색, 마이크로 CT 이미지 획득 및 표준 처리를 거치는 포괄적인 프로토콜이 제시됩니다. 이미지 처리에는 전체 머리와 뇌의 3D 볼륨 분할과 형태 분석에 사용할 수 있는 점 좌표를 디지털화하기 위한 특정 해부학적 평면 선택이 포함됩니다. 여기서는 신생아 쥐의 뇌에 초점을 맞추고 있지만, 다른 연조직에도 비슷한 전략을 적용할 수 있습니다. 따라서 여기에 제시된 프로토콜은 미묘한 수정을 통해 다른 유형의 샘플에 적용할 수 있을 만큼 충분히 유연합니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 캐나다 동물 보호 위원회의 지침을 따랐습니다.

1. 시료 채취 및 준비

  1. 4% 파라포름알데히드(PFA) 500mL를 준비합니다.
    1. 캐비닛의 추출 플럭스에서 1L 유리 비커에 있는 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 250mL에 PFA 분말 20g을 추가합니다. 자석이 있는 비커를 자석 교반판에 놓습니다.
    2. 가열하면서 저어줍니다. 온도계를 사용하여 용액의 온도를 지속적으로 확인하여 60 °C 미만으로 유지하십시오.
    3. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 용액에 1M NaOH 방울을 추가하여 PFA를 용해시킵니다. PFA 분말이 완전히 용해되면 용액을 실온(RT)에서 식힙니다.
    4. 1x PBS를 사용하여 용량을 500mL로 조정합니다. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 7.2M HCl 방울을 추가하여 pH를 7.3-1로 조정합니다.
    5. 종이 필터와 유리 깔때기를 사용하여 1L 유리병에 용액을 여과합니다.
    6. 유리병을 닫고 플럭스 캐비닛에서 꺼낸 다음 -4°C의 냉장고에 보관합니다.
  2. 뇌 샘플을 수집합니다.
    1. 샘플을 얻기 위해 희생 쥐 신생아는 출생 다음날 아침, 생후 0.5일(P 0.5)에 수술용 가위를 사용하여 목을 베었습니다.
    2. 몸을 잡고 신생아의 목에 가위를 놓고 한 번에 깔끔하게 자릅니다.
  3. PFA에 샘플을 고정합니다.
    1. 50mL 원뿔형 튜브에 4% PFA 40mL를 채웁니다.
    2. 고정제로 PFA가 들어 있는 튜브에 각 헤드를 담그십시오. 이 작업을 위해 Paton 주걱이나 숟가락을 사용하십시오.
    3. 원뿔형 튜브를 -4°C의 냉장고에서 48시간 동안 보관한 다음 방부제로 0.1% 아지드화나트륨을 사용하여 40mL의 1x PBS로 변경합니다. -4 °C에서 냉장 보관하십시오.

2. 시료 염색

  1. Lugol의 용액(3.75% w/v)을 준비합니다.
    1. 캐비닛의 추출 플럭스 아래에서 1L 유리 비커에 10g의 Kl 및 5g의I2 를 400mL의 증류수에 녹이고 자석 교반기를 사용하여 일정하게 혼합합니다.
  2. 40mL의 Lugol 용액이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 각 헤드를 담그십시오.
    1. 몸 크기가 약 1.3g인 신생아의 경우 오비탈 셰이커를 사용하여 일정한 혼합으로 샘플을 15-20시간 동안 담그십시오.
    2. 스캔하기 전에 10mL의 1% 아가로스가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 샘플을 30분 동안 넣습니다.

3. Micro-CT 스캐닝

알림: Micro-CT 스캔에는 특정 장비가 필요합니다. 이러한 종류의 스캐너에는 다양한 옵션이 있으며 획득에 대한 세부 사항은 사용된 장비의 특성에 따라 다릅니다. Hallgrímsson 박사의 연구실은 마이크로 CT 스캐너의 몇 가지 대안에 의존하고 있습니다. 여기서 프로토콜은 전 세계 실험실에서 사용하는 접근성이 높은 소형 동물 이미징 기계 중 하나인 기본 데스크톱 스캐너의 사용을 기반으로 합니다. 스캔 목표가 두개골인 경우 프로토콜의 섹션 2에 있는 단계를 건너뛰고 섹션 3으로 진행합니다. 두개골을 스캔한 후 염색 과정과 뇌 스캔을 수행하여 뇌와 두개골의 동일한 표본에서 이미지를 얻을 수 있습니다.

  1. 샘플을 micro-CT 홀더에 넣습니다.
    1. 샘플을 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 스캐너 세션 중 움직임을 피하기 위해 샘플을 수정합니다. 이를 위해 일부 폴리 우레탄 재료를 사용하여 튜브의 빈 부분을 채울 수 있습니다.
    2. 장비를 열고 샘플이 있는 튜브를 micro-CT 홀더에 넣습니다.
    3. micro-CT 제어판에 로그인하고 스캔할 샘플을 등록합니다. 이렇게 하면 샘플 번호가 자동으로 생성됩니다. 번호 외에도 "이름" 필드를 작성하십시오. 샘플 이름과 번호는 원시 데이터를 다시 검색해야 하는 경우를 대비하여 다른 곳(예: 스프레드시트)에 기록해야 합니다.
    4. 스캔 프로그램을 시작합니다. 샘플 이름 또는 번호를 입력하고 스캔 매개변수가 포함되어야 하는 제어 파일을 선택합니다.
  2. 샘플을 스캔합니다.
    1. micro-CT 소프트웨어 화면에서 0.012mm의 등방성 복셀 크기, 45kVp, 177lA, 800,000ms 통합 시간 및 500°당 180개의 투영 매개변수를 설정합니다.
    2. Scout View를 선택하여 스캔 영역을 설정합니다. 참조 이미지가 나타나면 기준선을 눌러 영역을 설정합니다. 녹색 실선을 샘플의 가장자리로 이동한 다음 Shift 키를 누른 상태에서 커서를 드래그하여 스캔 영역을 샘플의 다른 가장자리로 확장합니다.
    3. 확인을 선택하여 스캔을 시작합니다.
  3. 스캔을 평가하고 내보냅니다.
    1. micro-CT 스캐너 평가 프로그램을 열고 샘플 및 측정 선택을 클릭합니다. 필터 필드에 샘플 이름을 입력하고, 샘플을 선택하고, 측정 파일을 선택합니다.
    2. 파일은 슬라이스로 로드되며 그 수는 초기 스캔 창에 따라 다릅니다. Load All 버튼을 클릭하면 모든 슬라이스를 로드하고 나중에 슬라이스 간 이동을 용이하게 합니다.
    3. 작업 > Evaluation 3D를 선택하여 조각 주위의 자르기 상자를 초기화합니다. 작업/평가, VOI(관심 볼륨), 시작 X, Y, Z 및 치수 X, Y, Z를 포함한 여러 필드와 함께 3D 평가 프롬프트가 나타납니다.
    4. 재구성, 분할, 형태 측정(예: 골밀도) 및 파일 변환 또는 전송과 같은 다양한 평가 작업을 수행할 수 있으므로 작업 > 평가 3D 필드를 적절한 스크립트로 설정합니다. 기본 평가 스크립트를 가이드로 사용할 수 있습니다.
    5. 스크립트를 선택한 후 메인 이미지의 VOI 상자를 조정합니다. 첫 번째 조각에서 시작합니다. 상자에 평가할 해부학적 구조가 포함되어 있는지 확인합니다. 상자 가장자리 쪽으로 작은 흰색 사각형 중 하나를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 마우스 가운데 버튼을 사용하여 VOI의 크기를 조정하여 VOI를 이동합니다. 또는 차원 필드를 숫자로 조정합니다.
    6. 이미지 아래의 스크롤 막대를 사용하여 샘플을 통과하여 모든 해부학이 VOI 상자에 캡처되었는지 확인합니다. 소프트웨어 왼쪽 상단 근처에 있는 XY, XZ 또는 YZ 를 클릭하여 방향을 변경합니다.
    7. 평가 시작을 선택합니다. 작업 평가 스크립트에 따라 해당 .txt 헤더 파일이 있는 3D .aim 이미지 파일이 생성됩니다. 또한 스크립트에서 FTP(파일 전송 프로토콜)에 대한 경로를 특정 위치로 지정할 수 있습니다.

4. 이미지 처리

  1. 이미지 처리 소프트웨어에서 이미지를 엽니다.
    참고: 이미지 처리는 다양한 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 해당 분야에서 널리 사용되는 상용 소프트웨어의 기본 단계가 포함되어 있으며 기본 및 고급 처리를 위한 다양한 도구가 있습니다. 또한 재구성된 마이크로 CT 이미지에 대해 허용되는 다양한 형식이 있습니다. 이 측면은 일반적으로 획득에 사용되는 장비와 해당 소프트웨어에 따라 다릅니다. 여기서, .bmp 이미지로 이미지 처리가 수행된다. .tiff 이미지 및 기타 유형에 동일한 절차를 적용할 수 있습니다. 획득은 .aim을 기본 형식으로 사용하는 스캐너에서 수행되므로 .aim 에서 .bmp 로의 변환이 먼저 표시됩니다.
    1. .aim 파일을 열려면 파일 > 데이터 열기 를 선택하고 파일을 선택합니다. 그런 다음 파일 형식 선택이라는 제목의 창이 열립니다. Raw Data(원시 데이터)를 선택합니다.
    2. Raw Data Parameters(원시 데이터 파라미터)라는 제목의 창이 열립니다. 이 창에서 각 .aim 파일에 대해 생성된 헤더 .txt 파일의 정보 다음에 파라미터를 입력합니다. Data Type(데이터 유형)에서 Image data starts at byte offset(바이트 오프셋에서 이미지 데이터 시작) 뒤의 숫자와 함께 header complete(헤더 완성)에 대해 16비트 를 선택합니다. 또한 헤더 .txt 파일의 정보를 사용하여 크기와 복셀 크기를 설정합니다. 매개변수가 완료되면 OK를 누릅니다.
    3. .aim에서 .bmp로 변환해야 하는 경우 [메인 패널] > [프로젝트 뷰]에서 .aim 개체를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 [이미지 유형 변환> 변환] 옵션을 선택합니다. Properties(속성)에서 Output Type(출력 유형)으로 8-bit(8비트)를 선택합니다. 적용을 선택합니다.
    4. 새 8비트 개체를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 다른 이름으로 저장을 선택합니다. .bmp 선택하고 저장합니다.
    5. .bmp 파일을 열려면 파일 > 데이터 열기 를 선택하고 파일을 선택합니다. 그런 다음 이미지의 매개 변수가있는 창이 열립니다. 매개 변수를 확인하고 올바른 경우 수락합니다.
    6. [메인 패널] > [프로젝트 뷰]에서 .bmp 파일의 이름으로 새 오브젝트가 만들어집니다. 이 오브젝트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Ortho Slice 옵션을 선택합니다. 속성에서 볼 슬라이스 번호와 방향 평면을 선택합니다.
  2. 전체 헤드의 3D 볼륨을 얻습니다.
    1. Main Panel(메인 패널) > Project View(프로젝트 뷰)에서 이미지 개체를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. Create(생성)> Interactive Thresholding(대화형 임계값 설정) 옵션을 선택합니다. 속성에서 동물의 머리에 해당하는 이미지 부분이 선택될 때까지 최소 RGB 및 최대 RGB 값을 변경합니다. 적용을 선택합니다.
    2. [메인 패널] > [프로젝트 뷰]에서 임계값이 있는 오브젝트가 만들어집니다. 이 객체를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 속성에서 Isosurface를 선택합니다. 속성(Properties)에서 표면을 시각화할 임계값을 선택하고 적용(Apply)을 클릭합니다. 이 임계값은 경험적으로 선택해야 하며, 다른 값을 검사해야 할 수 있습니다.
  3. 점 좌표 디지타이징
    1. 3D 점 좌표는 슬라이스 또는 추출된 표면을 기반으로 디지타이징할 수 있습니다. 첫 번째 옵션의 경우 이미지 옵션을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Slice를 선택합니다. [Translate]에서 축 평면에서 원하는 슬라이스를 선택합니다. 평면이 올바르게 배치되지 않은 경우 특성(Properties)에서 옵션(Options) > 회전(Rotate)을 클릭하여 올바른 방향을 설정합니다.
    2. 랜드마크를 디지타이즈하려면 메인 패널(Main Panel) > 프로젝트 뷰(Project View)에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 오브젝트 생성(Create Object > Points and Lines > Landmarks)을 선택합니다. 새 Object Landmarks를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Landmark View를 선택합니다. [Landmark View]에서 [Size]의 포인트 크기를 수정합니다. 속성에서 랜드마크를 추가하려면 편집 모드에서 추가 옵션을 사용합니다.
      참고: 신생아의 경우, 뇌의 축 및 시상 곡선 주변의 일련의 랜드마크 및 준랜드마크가 이전에 발표되었다14.
    3. 먼저, 후각구의 가장 중심점과 피질의 가장 꼬리점을 가로지르는 축면을 선택합니다.
    4. Object Landmarks(개체 랜드마크)를 선택하고 Properties(속성)에서 Landmark Editor(랜드마크 편집기)를 선택합니다. 화살표를 사용하여 점을 디지털화할 위치를 클릭합니다.
    5. 제안된 랜드마크 세트에서 24개의 점이 선택한 축 평면에서 디지타이즈됩니다. 정중선에서 뇌의 가장 꼬리 부분에 있는 첫 번째 부분을 디지털화합니다.
    6. 중뇌와 피질 사이의 교차점에 있는 다음 랜드마크까지 곡선 주위에 균등하게 분포된 5개의 점(반랜드마크)을 디지털화합니다.
    7. 그런 다음 피질 주위의 8개 점(세미 랜드마크)을 디지타이즈합니다.
    8. 피질과 후각 전구 사이의 교차점에 있는 새로운 랜드마크를 디지털화합니다. 그런 다음 후각 전구 주위의 4개 점(세미 랜드마크)을 디지타이즈합니다.
    9. 중간선에 있는 후각 전구의 가장 로스트랄 지점에 있는 새로운 랜드마크를 디지털화합니다. 그런 다음 두 후각 전구 사이에 있는 두 점(세미 랜드마크)을 디지타이징합니다.
    10. 중간선에 있는 후각구의 가장 꼬리 부분에 있는 새로운 랜드마크를 디지털화합니다.
    11. 시상점의 경우 뇌가 꼬리로 가장 두드러지는 시상부면에 뇌의 오른쪽에 슬라이스를 설정합니다.
    12. 제안된 랜드마크 세트에서 33개의 포인트가 선택된 파라사지탈 평면에서 디지털화됩니다. 간뇌와 후뇌 사이의 교차점에서 첫 번째를 디지털화합니다. 그런 다음 뇌의 복부 한계에 있는 9개의 지점(반랜드마크)을 디지털화합니다.
    13. 후각구의 가장 중심에 있는 새로운 랜드마크를 디지털화합니다. 그런 다음 후각 전구 주위의 세 점(세미 랜드마크)을 디지타이즈합니다.
    14. 후각구와 피질 사이의 교차점에 있는 새로운 랜드마크를 디지털화합니다. 그런 다음 후각 전구 주위의 세 점(세미 랜드마크)을 디지타이즈합니다.
    15. 후각구와 피질 사이의 교차점에 있는 새로운 랜드마크를 디지털화합니다. 그런 다음 피질 주위의 7개 점(세미 랜드마크)을 디지타이즈합니다.
    16. 피질(cortex)과 중뇌(midbrain) 사이의 교차점에 있는 새로운 랜드마크를 디지털화합니다. 그런 다음 피질 주위의 7개 점(세미 랜드마크)을 디지타이즈합니다.
    17. 피질(cortex)과 중뇌(midbrain) 사이의 교차점에 있는 새로운 랜드마크를 디지털화합니다. 그런 다음 중뇌 주위의 6개 점(반랜드마크)을 디지털화합니다.
    18. 중뇌와 소뇌 사이의 교차점에 있는 새로운 랜드마크를 디지털화합니다. 그런 다음 소뇌 주위의 두 점(세미 랜드마크)을 디지타이즈합니다.
    19. 소뇌와 후뇌 사이의 교차점에 있는 새로운 랜드마크를 디지털화합니다.
    20. 디지타이즈된 점을 저장합니다. Object Landmarks 를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Save Data 옵션을 선택합니다.
  4. 점 좌표를 분석합니다.
    참고: 시편 세트에 대한 점 좌표가 디지털화되면 기하학적 형태 측정 도구를 사용하여 기본 분석을 수행하여 크기(중심 크기)와 형상 변수(형상 또는 Procrustes 좌표)를 얻을 수 있습니다. 분석은 특히 통계 분석에 적합한 무료 개방형 소프트웨어 환경에서 수행됩니다.
    1. 메모장을 사용하여 디지털화된 모든 표본의 좌표가 포함된 파일을 만듭니다. 이를 위해 https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm 에 설명된 대로 TPS 형식을 따릅니다.
    2. 통계 소프트웨어를 엽니다. 파일 > 디렉터리 변경을 선택하여 .tps 파일이 저장되는 디렉터리를 선택합니다.
    3. 패키지 > 패키지 설치를 선택합니다. 하나의 Cran Mirror를 선택합니다. geomorph를 찾아 설치하십시오.
    4. 콘솔에 library(geomorph) 및 library(Morpho)를 입력하여 패키지를 로드합니다.
    5. 콘솔에 dataset <- readland.tps(file="NAME_OF_FILE.tps", specID="ID")를 입력하여 데이터 세트를 로드합니다.
    6. 콘솔에 GPA<- gpagen(dataset)을 입력하여 일반화된 Procrustes 분석을 수행합니다.
    7. 콘솔에 CS<-GPA$Csize를 입력하여 중심 크기를 구합니다.
    8. 콘솔에 ProcCoord<- GPA$coords를 입력하여 Procrustes 좌표를 가져옵니다.
    9. 콘솔에 plotAllSpecimens(ProcCoord)를 입력하여 프로크루스테스 좌표와 평균 형상을 플로팅합니다.
  5. ROI 세분화
    참고: 뇌를 분할하고 3D 재구성을 얻으려면 각 절편의 뇌 조직을 수동으로 식별하십시오. 동일한 절차를 후각 전구, 피질 등과 같은 특정 ROI에 적용할 수 있습니다.
    1. 메인 패널(Main Panel) > 프로젝트 뷰(Project View)를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 오브젝트 > 레이블 필드 생성(Create Object Label Field) 을 선택합니다.
    2. Label Field 객체를 선택하고 Properties에서 Segmentation Editor 옵션을 누릅니다.
    3. 머티리얼에서 새 머티리얼을 추가하고, 원하는 경우 이름을 Brain으로 바꿉니다.
    4. [선택]에서 [현재 슬라이스] 옵션을 선택하여 각 슬라이스의 뇌에 해당하는 조직을 분할합니다.
    5. 도구에 있는 옵션을 사용하여 각 조각의 뇌 조직을 선택합니다. 이 경우 마술 지팡이와 브러시가 가장 적합합니다.
    6. 각 슬라이스에서 선택이 완료되면 [선택 영역]에서 [추가]를 누릅니다.
    7. 모든 슬라이스에서 선택이 완료되면 메인 패널의 프로젝트 뷰로 돌아가 Label Field를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 Generate Surface를 선택한 다음 Apply를 클릭합니다.
    8. 표면을 얻은 후에는 Extract Surface를 적용하여 내보냅니다.
    9. 분할된 구조의 부피를 구하려면 [메인 패널] > [프로젝트 뷰]에서 레이블이 포함된 개체를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 [부피 분율 측정 및 분석]> 선택합니다. 그런 다음 적용을 클릭합니다.

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결과

여기에서는 신생아 쥐 뇌의 고해상도 이미지를 얻기 위한 기본 프로토콜이 제시됩니다. 머리는 Lugol의 용액에 담근 후 스캔되었습니다. 작은 크기에도 불구하고 후각구, 피질, 중뇌, 소뇌, 후뇌와 같은 주요 뇌 해부학적 구조를 구별할 수 있습니다(그림 1).

이러한 이미지를 입력으로 사용하여 다양한 분석을 수행할 수 있습니다. 두 개의 서로 다른 해부학적 평면에 있는 일련의 랜드마크와 준랜드마크가 디지털화되었습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 점들은 뇌의 경계를 따라 선택된 평면에 배치되어 있습니다. 디지털화가 완료되면 점의 좌표를 .txt 파일로 읽을 수 있습니다(그림 3). 점 디지털화의 목적은 기하학적 형태 분석에 추가로 사용할 수 있는 원시 좌표를 얻는 것이었습니다. 제시된 프로토콜은 단일 표본에 초점을 맞추고 있...

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토론

이 연구에서는 조영제가 있는 마이크로 CT를 사용하여 생쥐의 신생아 뇌 조직을 스캔하는 간결한 프로토콜을 소개합니다. 또한 정량적 및 정성적 출력을 얻기 위한 간단한 절차가 포함되어 있습니다. 이러한 방법을 기반으로 추가 대체 또는 보완 분석을 수행할 수 있습니다.

프로토콜에서 볼 수 있듯이 마이크로 CT 이미지는 다양한 방식으로 분석할 수 있습니다. 이전 연구에서 우리 그룹은 점의 좌표를 디지털화하고 기하학적 형태 측정 기법을 적용하여 생쥐의 주산기 뇌의 크기와 모양 변화를 추정했습니다 8,14. 좌표의 디지털화는 간단한 유클리드 거리 추정을 사용하여 선형 측정값을 얻는 데에도 유용합니다. 이는 뇌 및 ROI 분할에서 파생된 볼륨과 함께 전통적인 형태 측정 평가에 유용한 입력입니다.

여기에 제시된 프로토콜은 우리가 사용한 것...

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공개 사항

저자는 서로 상충되는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

Wei Liu의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 ANPCyT PICT 2017-2497 및 PICT 2018-4113의 자금 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
  &마이크로; CT 35Scanco Medical AGScanco는   µ CT 35 이상. 그들의 가장 작은 스캐너는 이제  &마이크로; 코네티컷 45 
AvizoVisualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 MiceBioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Conical tubesDaiggerCH-CI4610-1856
플럭스 캐비닛EscoAC2-458 
유리 비커 GlasscoGL-229.202.10
유리병SimaxCFB017
유리 깔때기HDAVI1108
HClCarlo Erba403872플럭스 캐비닛 아래에서 조작하고 개인 보호 장비(마스크, 유리 및 장갑)를 사용합니다.
I2Cicarelli804211I2KI를 준비할 때 플럭스 캐비닛 아래에서 조작하고 개인 보호 장비(마스크, 유리 및 장갑)를 사용합니다.
KICicarelliPA131542.1210I2KI를 준비할 때 플럭스 캐비닛 아래에서 조작하고 개인 보호 장비(마스크, 유리 및 장갑)를 사용합니다.
자기 교반Arcano4925
NaOHCicarelli1580110플럭스 캐비닛 아래에서 조작하고 개인 보호 장비 (마스크, 유리 및 장갑)를 사용하십시오.
오비탈 쉐이커BiomintBM021
파라포름알데히드 Biopack2000959400플럭스 캐비닛 아래에서 조작하고 개인 보호 장비 (마스크, 유리 및 장갑)를 사용하십시오
.Paton 주걱GlasscoGL-377.303.01
PBSBiopack2000988800
플라스틱 파스퇴르 피펫Daigger9153
RR ProjectR용 geomorph 패키지는 프로토콜 (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Scissors Belmed
Sodium azideBiopack2000163500
온도계Daigger7650

참고문헌

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