이 연구는 생체 외 샘플에서 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT)과 조영제를 결합하여 신생아 마우스 뇌의 고해상도 이미지를 얻는 단계를 설명합니다. 우리는 이러한 이미지에서 뇌 크기와 모양을 정량화하기 위한 기본 형태 분석을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
신경 영상은 동물 모델을 사용한 실험에서 뇌 형태를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 자기공명영상(MRI)은 연조직의 표준 방법이 되었지만, 공간 해상도가 낮아 작은 동물에게는 한계가 있습니다. 여기서는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT)을 사용하여 생쥐 신생아 뇌 및 두개골에 대한 고해상도 3차원(3D) 정보를 얻기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 샘플을 해부하고, 뇌를 염색 및 스캔하고, 전체 장기 및 관심 영역(ROI)의 형태 측정 측정값을 얻는 데 필요한 단계가 포함됩니다. 이미지 분석에는 구조의 분할과 점 좌표의 디지털화가 포함됩니다. 요컨대, 이 연구는 조영제로서 마이크로 CT와 Lugol의 용액을 조합하는 것이 작은 동물의 주산기 뇌를 이미징하는 데 적합한 대안임을 보여줍니다. 이 이미징 워크플로우는 발달 생물학, 생물의학 및 다양한 유전적 및 환경적 요인이 뇌 발달에 미치는 영향을 평가하는 데 관심이 있는 기타 과학에 적용됩니다.
서론
마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT) 영상은 다양한 연구 분야에 유용한 도구입니다. 생물학에서는 광물화 된 조직의 X 선 흡수로 인해 뼈 연구에 특히 적합합니다. 이러한 특성으로 인해, 뼈 발달(bone development)1, 신진대사(metabolism)2, 진화(evolution)3,4 등에 관한 다양한 질문들이 micro-CT의 도움을 받아 접근되었다. 2008년 de Crespigny 등은 요오드를 조영제로 사용하여 성체 쥐와 토끼 뇌의 마이크로 CT 이미지를 얻을 수 있음을 보여주었습니다. 이 작업은 요오드가 X선에 둔감한 연조직으로부터 이미지를 획득할 수 있게 해주었기 때문에 이 이미징 기술에 대한 새로운 응용 프로그램을 열었습니다. 따라서 마이크로 CT와 요오드 기반 조영제를 결합하는 일반적인 목표는 중조직 또는 거시 해부학적 수준에서 연조직을 구별하고 식별할 수 있는 고해상도 이미지를 얻는 것입니다.
이 기술은 실험 설계에 널리 사용되는 마우스 배아....
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프로토콜
모든 실험 절차는 캐나다 동물 보호 위원회의 지침을 따랐습니다.
1. 시료 채취 및 준비
- 4% 파라포름알데히드(PFA) 500mL를 준비합니다.
- 캐비닛의 추출 플럭스에서 1L 유리 비커에 있는 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 250mL에 PFA 분말 20g을 추가합니다. 자석이 있는 비커를 자석 교반판에 놓습니다.
- 가열하면서 저어줍니다. 온도계를 사용하여 용액의 온도를 지속적으로 확인하여 60 °C 미만으로 유지하십시오.
- 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 용액에 1M NaOH 방울을 추가하여 PFA를 용해시킵니다. PFA 분말이 완전히 용해되면 용액을 실온(RT)에서 식힙니다.
- 1x PBS를 사용하여 용량을 500mL로 조정합니다. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 7.2M HCl 방울을 추가하여 pH를 7.3-1로 조정합니다.
- 종이 필터와 유리 깔때기를 사용하여 1L 유리병에 용액을 여과합니다.
- 유리병을 닫고 플럭스 캐비닛에서 꺼낸 다음 -4°C의 냉장고에 보관합니다.
- 뇌 샘플을 수집합니다.
- 샘플을 얻기 위해 희생 쥐 신생아는 출생 다음날....
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결과
여기에서는 신생아 쥐 뇌의 고해상도 이미지를 얻기 위한 기본 프로토콜이 제시됩니다. 머리는 Lugol의 용액에 담근 후 스캔되었습니다. 작은 크기에도 불구하고 후각구, 피질, 중뇌, 소뇌, 후뇌와 같은 주요 뇌 해부학적 구조를 구별할 수 있습니다(그림 1).
이러한 이미지를 입력으로 사용하여 다양한 분석을 수행할 수 있습니다. 두 개의 서로 다른 해부학적 평면에 있는 일련의 랜드마크와 준랜드마크가 디지털화되었습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 점들은 뇌의 경계를 따라 선택된 평면에 배치되어 있습니다. 디지털화가 완료되면 점의 좌표를 .txt 파일로 읽을 수 있습니다(그림 3). 점 디지털화의 목적은 기하학적 형태 분석에 추가로 사용할 수 있는 원시 좌표를 얻는 것이었습니다. 제시된 프로토콜은 단일 표본에 초점을 맞추고 있.......
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토론
이 연구에서는 조영제가 있는 마이크로 CT를 사용하여 생쥐의 신생아 뇌 조직을 스캔하는 간결한 프로토콜을 소개합니다. 또한 정량적 및 정성적 출력을 얻기 위한 간단한 절차가 포함되어 있습니다. 이러한 방법을 기반으로 추가 대체 또는 보완 분석을 수행할 수 있습니다.
프로토콜에서 볼 수 있듯이 마이크로 CT 이미지는 다양한 방식으로 분석할 수 있습니다. 이전 연구에서 우리 그룹은 점의 좌표를 디지털화하고 기하학적 형태 측정 기법을 적용하여 생쥐의 주산기 뇌의 크기와 모양 변화를 추정했습니다 8,14. 좌표의 디지털화는 간단한 유클리드 거리 추정을 사용하여 선형 측정값을 얻는 데에도 유용합니다. 이는 뇌 및 ROI 분할에서 파생된 볼륨과 함께 전통적인 형태 측정 평가에 유용한 입력입니다.
여기에 제시된 프로토콜은 우리가 사용한 것.......
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공개 사항
저자는 서로 상충되는 이해관계가 없다고 선언한다.
감사의 글
Wei Liu의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 ANPCyT PICT 2017-2497 및 PICT 2018-4113의 자금 지원을 받습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| &마이크로; CT 35 | Scanco Medical AG | Scanco는 µ CT 35 이상. 그들의 가장 작은 스캐너는 이제 &마이크로; 코네티컷 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conical tubes | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| 플럭스 캐비닛 | Esco | AC2-458 | |
| 유리 비커 | Glassco | GL-229.202.10 | |
| 유리병 | Simax | CFB017 | |
| 유리 깔때기 | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | 플럭스 캐비닛 아래에서 조작하고 개인 보호 장비(마스크, 유리 및 장갑)를 사용합니다. |
| I2 | Cicarelli | 804211 | I2KI를 준비할 때 플럭스 캐비닛 아래에서 조작하고 개인 보호 장비(마스크, 유리 및 장갑)를 사용합니다. |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | I2KI를 준비할 때 플럭스 캐비닛 아래에서 조작하고 개인 보호 장비(마스크, 유리 및 장갑)를 사용합니다. |
| 자기 교반 | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | 플럭스 캐비닛 아래에서 조작하고 개인 보호 장비 (마스크, 유리 및 장갑)를 사용하십시오. |
| 오비탈 쉐이커 | Biomint | BM021 | |
| 파라포름알데히드 | Biopack | 2000959400 | 플럭스 캐비닛 아래에서 조작하고 개인 보호 장비 (마스크, 유리 및 장갑)를 사용하십시오 |
| .Paton 주걱 | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| 플라스틱 파스퇴르 피펫 | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | R용 geomorph 패키지는 프로토콜 (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Scissors | Belmed | ||
| Sodium azide | Biopack | 2000163500 | |
| 온도계 | Daigger | 7650 |
참고문헌
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al.
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재인쇄 및 허가
