쥐 관절염 조직에서 Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts의 분리 및 배양

류마티스 관절염 (RA)은 활액막의 증식을 특징으로하는자가 면역 질환으로 관절 파괴를 유발합니다 ^1,2. 조직에 상주하는 대식세포와 섬유아세포는 관절 항상성을 유지하기 위해 건강한 활막에 존재합니다. RA 환자에서, 활막 섬유아세포(SFs)가 증식하고, 단핵구를 포함한 면역 세포가 활막 및 관절액으로 침윤하며, 염증과 관련된 과정이다 ^1,3,4. 상주 대식세포 및 말초 혈액 단핵구 유래 대식세포를 포함하는 활막 대식세포(SM) 및 SF는 비정상적으로 활성화되며 RA 발병기전에서 중요한 역할을 합니다. 최근 연구에 따르면 SM과 SF 사이의 세포-세포 상호작용은 RA ^5,6의 악화 및 완화 모두에 기여합니다.

RA 발병기전을 이해하기 위해 K/BxN 혈청 전달 관절염, 콜라겐 유도 관절염 및 콜라겐 항체 유도 관절염을 포함하여 염증성 관절염의 여러 설치류 모델이 사용되었습니다. 세포 기반 분석은 일반적으로 관절염의 분자 기능을 명확히 하는 데 필요합니다. 따라서 관절염 동물 모델로부터의 일차 세포가 분리되었다. 쥐의 관절염 조직으로부터 SF를 분리하는 방법은 잘 확립되어 있으며, 이들 세포는 관절염 발병기전에서 분자 기전의 해명에 기여하였다 ^7,8. 한편, 골수 유래 대식세포, 혈액 단핵구 유래 대식세포 및 대식세포 세포주는 관절염 연구를 위한 대식세포 자원으로 자주 사용되어 왔다 ^9,10. 대식세포는 미세 환경과 관련된 기능을 획득할 수 있기 때문에 대식세포의 일반적인 공급원은 관절염 조직에 특이적인 반응이 부족할 수 있습니다. 또한, 쥐의 활막은 관절염 모델에서도 매우 작은 조직이기 때문에 분류하여 충분한 활막 세포를 얻는 것이 어렵습니다. 시험관 내 연구를 위한 활막 대식세포의 사용 부족은 관절염 연구의 한계였습니다. 활막 대식세포를 분리하고 확장하기 위한 프로토콜의 확립은 RA에서 병리학적 기전을 밝히는 데 이점이 될 것입니다.

SF를 분리하는 이전 방법에서는 SM을 폐기했습니다⁷. 그 외에도 일부 장기에서 상주하는 대식세포를 분리하고 확장하는 방법이 보고되었다¹¹. 따라서 기존 프로토콜이 조합되어 수정되었습니다. 수정은 고순도로 SM과 SF 모두의 1차 배양을 달성하는 것을 목표로 합니다. 이 방법의 전반적인 목표는 쥐 관절염 조직에서 SM과 SF를 모두 분리하고 확장하는 것입니다.

동물을 대상으로 한 실험은 에히메대학 동물실험위원회의 승인을 받아 에히메대학 동물실험 지침(37A1-1*16)에 따라 실시했습니다.

1. 기구, 시약 및 배양액의 준비

1. 다음과 같이 배양 배지를 준비합니다: Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 항생제-항진균 용액(항-항균제)을 보충합니다.
2. 다음과 같이 소화 배지를 준비합니다: 배양 배지에 1mg/mL 콜라게나제 유형 IV를 보충합니다. 사용 직전에 콜라게나제 농도를 조절하십시오.
3. 유형 I-C 콜라겐을 0.15mM HCl 용액으로 1mg/mL 농도로 희석합니다. 홍수 배양 접시 (직경 40 또는 60 mm)에 희석 된 콜라겐 용액을 넣습니다. 실온에서 6-12 시간 후, 접시에서 콜라겐 용액을 제거하고 실온에서 건조시킵니다. 콜라겐으로 코팅된 접시는 실온에서 최소 1주일 동안 보관할 수 있습니다. 사용하기 전에 미리 코팅된 접시를 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 배지로 세척하십시오.
4. 가위, 끝이 톱니 모양의 핀셋, 가는 핀셋과 같은 멸균 수술 기구를 준비합니다. 사용하기 전에 70% 에탄올에 담그십시오.

2. 생쥐의 활막염 조직의 제조 ( 도 1A)

1. 뒷발에 염증성 관절염이있는 마우스를 준비하십시오.
   참고: 콜라겐 항체 유발 관절염(CAIA) 또는 K/BxN 혈청 이식 관절염(STA)이 있는 출생 후 7-8주 암컷 C57BL/6 마우스(18-20g)가 이 프로토콜에 사용되었습니다⁸. 부풀어 오르지 않은(즉, 건강한) 조직에서 SM을 분리하는 것은 세포 수가 부족하기 때문에 어려울 수 있습니다.
2. 80mg/kg 케타민과 16mg/kg 자일라진을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다. 70 % 에탄올로 마우스를 청소하십시오.
3. 가슴 부위를 가위로 잘라 심장을 노출시킵니다. 가위로 심장의 오른쪽 귓바퀴를 자른 다음 23G 나비 바늘을 심장 정점을 통해 좌심실에 꽂은 다음 주사기를 사용하여 멸균 PBS 15-20mL를 환류시켜 말초 혈액을 수동으로 제거합니다(약 1mL/2초).
4. 가위를 사용하여 피부를 자르고 톱니 모양의 팁이 있는 핀셋을 사용하여 피부를 당겨 뒷발을 장식합니다.
   알림: 이 단계 후에는 s를 취급할 때 핀셋을 사용하는 것이 좋습니다.amp르. 쥐 털이 붙는 것을 피하기 위해 손가락으로 절피 된 조직을 만지지 마십시오.
5. 잡아당겨 중족지절관절을 탈구시킨 후 가위로 관절의 인대를 절단하여 발가락을 제거합니다.
6. 가위를 사용하여 발목 근처의 다리 근육의 힘줄을 자릅니다. 핀셋으로 힘줄을 잡고 다리 아래쪽의 근위부 근육을 벗겨 경골을 노출시킵니다. 비골을 제거하십시오.
7. 당겨서 무릎 관절을 탈구시킨 다음 가위로 관절의 인대를 절단하여 부은 뒷발로 경골을 분리합니다. 3.1단계로 처리할 때까지 샘플을 얼음처럼 차가운 배양 배지(0.3mL/^cm2)에 보관합니다.

3. 활액막염 조직의 소화 ( 그림 1B)

1. 샘플을 피하고 배양 배지를 흡인한 다음 신선한 배양 배지(0.3mL/^cm2)를 추가합니다. 세척 과정을 서너 번 반복하십시오.
   알림: 이 단계부터 s의 취급amp깨끗한 벤치 또는 안전 캐비닛에서 무균 상태로 수행해야 합니다.
2. 실체 현미경(10x-20x 배율)에서 배양 배지의 미세 핀셋을 사용하여 당겨 샘플의 모든 관절을 탈구시킵니다. 이 단계에서는 미세한 핀셋이 편리합니다. 경골과 가능한 한 많은 혈관, 힘줄 및 인대를 제거하십시오. 탈구 할 때 뼈가 부러지지 않도록주의하십시오.
3. 시료당 2개의 15mL 튜브를 준비합니다. 핀셋을 사용하여 연조직이 있는 탈구된 뼈를 처음 15mL 튜브로 옮깁니다. 양쪽 뒷발에서 얻은 샘플당 4mL의 소화 배지를 튜브에 추가합니다.
4. 잔류 세포 및 조직 단편을 수집하기 위해, 샘플이 함유된 배지를 제2 15 mL 튜브로 옮긴다. 배지를 실온에서 5분 동안 500 x g 로 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후 펠릿을 1mL의 소화 배지로 재현탁하고 세포 및 조직 단편 용액을 거의 모든 조직(총 5mL의 소화 배지/뒷발)을 포함하는 처음 15mL 튜브로 옮깁니다.
5. 샘플을 하이브리드화 오븐에서 진탕하면서 37°C에서 60-120분 동안 분해한다.
   알림: 샘플을 소화하는 최적의 시간을 결정해야 합니다. 시간은 발목과 콜라겐 분해 효소의 붓기 정도에 따라 다릅니다. 대부분의 경우 60-120분이면 충분합니다. 배양 60분 후, 소화된 샘플의 일부를 피펫팅으로 수집하고, 현미경으로 관찰한다. 소화가 불충분하면 배양을 계속하고 30 분마다 소화를 점검해야합니다.
6. 용액을 잘 피펫하십시오. 세포 여과기(40μm 공극 크기)를 통해 세포 용액을 50mL 튜브로 여과합니다.
7. 세포 여과기를 통해 50mL 튜브에 배양액 10mL를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 300 x g 로 원심분리합니다.
8. 상층액을 제거한 후 배양액 10mL로 재현탁합니다. 원심 분리를 반복하십시오. 상층액을 제거한 후 2mL의 배양액으로 재현탁합니다.

그림 1: 쥐 관절염 조직 샘플링 및 콜라게나제 소화 절차. (ᅡ) (i) 염증성 관절염이 있는 쥐 뒷발. (ii) 뒷발의 피부 제거. (iii) 중족지절관절의 탈구 및 발가락 제거. (iv) 발목의 힘줄 절단. (v) 다리 아래 근육의 제거. (vi) 무릎 관절의 탈구. (b) 왼쪽; 배양 배지에서 절제된 다리. 오른쪽; 탈구된 tarsus 및 metatarsus 배양 배지에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 활막 섬유아세포의 분리( 그림 2A)

1. 양쪽 발목으로부터 얻은 모든 세포 현탁액을 콜라겐 코팅된 접시에 시드한다.
   참고: 부종이 약하거나 중간 정도인 발목을 사용하여 세포를 얻는 경우 직경 40mm의 접시를 적용합니다. 양쪽 발목이 심하게 부어오르면 콜라겐 코팅 접시 크기를 직경 60mm 접시로 변경할 수 있습니다.
2. 배양 배지(약 222μL/^cm2)를 추가합니다. 5%_CO2로 가습된 분위기에서 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
3. 피펫을 사용하여 부착되지 않은 세포를 수집합니다(5.1단계에서 사용). 콜라겐이 코팅된 접시를 배양액으로 세척하고 배지를 수거한다. 부착 세포를 신선한 배지에서 배양합니다(그림 2B, i). 콜라겐 코팅 접시에 빠르게 부착되는 대부분의 세포는 섬유아세포질(방추형) 형태를 나타냅니다.
4. 계대-합류성 세포는 행크스 평형염 용액(HBSS)에서 0.05% 트립신으로 처리하였다. 이 방법에서, 다른 세포의 오염은 초기 팽창 시에도 제한된다. 더 정제된 섬유아세포 유사 세포가 필요한 경우 순도를 높일 수 있도록 반복적인 계대배양을 수행합니다. 그러나 접착력에서 세포의 세포질 확장도 관찰됩니다(그림 2B, ii). 과도한 계대는 세포의 순진한 특성의 손실에 영향을 미치기 때문에 계대가 5 개 미만인 세포를 사용하십시오.

5. 활막 대식세포의 분리( 그림 2A)

1. 콜라겐으로 코팅되지 않은 접시(직경 40 또는 60mm)에 4.4단계의 모든 비부착 세포를 시딩합니다.
   참고: 비부착성 세포에는 대식세포, 기타 림프구 및 활막염 조직의 잔류 섬유아세포가 포함됩니다.
2. 벌크 세포를 5%_CO2로 가습된 분위기에서 37°C에서 1일 동안 배양하였다.
3. 비부착성 림프구를 제거하려면 배양된 배지를 흡인한 다음 새로운 배양 배지를 추가합니다. 이 과정을 두세 번 반복합니다(그림 2B, iii).
4. 부착된 벌크 세포를 배양 배지에서 1-2주 동안 배양하고 합류를 유지하면서 2일마다 배지를 교체합니다(그림 2B, iv).
   참고: SM의 수는 SF와의 공동 배양 조건에서 서서히 증가합니다. 따라서 공동 배양 기간은 필요에 따라 조정되어야 합니다.
5. PBS 또는 HBSS로 두 번 씻으십시오. HBSS (약 55 μL^/ cm 2)에서 0.05 % 트립신으로 3 ° C에서 37 분 동안 5 % CO₂로 가습 된 분위기에서 처리하십시오. 섬유아세포는 트립신 처리에 의해 배양 접시에서 쉽게 분리되며, 대식세포는 트립신 처리에 내성을 나타낸다. 활액 대 식세포의 선택에이 속성을 사용하십시오.
6. 배양 배지(약 222μL/^cm2)를 HBSS의 0.05% 트립신에 부드럽게 추가합니다. 이 단계 후에 배지를 세포에 직접 붓지 마십시오.
7. 분리된 세포를 제거하려면 배양된 배지를 흡인한 다음 신선한 배양 배지를 부드럽게 추가합니다. 이 과정을 두세 번 반복하십시오. 사용할 때까지 접시에 남아있는 세포를 신선한 배양 배지에 보관하십시오 (그림 2B, v).
   참고: 트립신 처리 후 부착 세포는 대식세포와 유사한 형태학적 특성을 나타냅니다.

그림 2: 염증성 관절염 조직에서 대식세포가 풍부한 분획과 섬유아세포가 풍부한 분획의 분리. (A) 관절염 조직에서 대식세포가 풍부한 세포와 섬유아세포가 풍부한 세포를 분리하는 절차의 도식. (B) 도 2A의 절차의 단계들, (i) 내지 (v)의 대표적인 위상차 이미지. 스케일 바는 100μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스는 콜라겐 항체 유발 관절염을 겪었습니다. 대식세포-유사 세포 및 섬유아세포-유사 세포는 상기 기술된 절차에 따라 염증성 관절염 조직으로부터 독립적으로 분리되었다(도 2A, B). 대식세포-유사 세포는 단계 5.7 직후에 사용하였다. 섬유아세포-유사 세포는 초기에 단계 4.4 후에 서브-컨플루언트(sub-confluent)가 되도록 배양한 다음, 새로운 배양 접시에 계대배양한 후 사용하였다. SM과 SF가 성공적으로 분리되었는지 여부를 평가하기 위해 다음과 같은 실험을 수행했습니다.

분리된 세포의 순도를 평가하기 위해, 다양한 세포 마커의 mRNA 발현을 RT-qPCR에 의해 분석하였다. Cd68, Emr1, Itgam 및 Csf1r을 범-대식세포 마커로 사용하였고, Cdh11, Col6a1, Csf1 및 Vcam1을 SF 마커로 사용하였다. Rplp0는 참조 유전자 6,8을 사용하였다. 모든 마커 유전자는 Rplp0 발현에 의해 정규화되었다. 두 세포 유형 마커는 대식세포-유사 세포에서 분석되었고, 섬유아세포-유사 세포는 관절염 조직으로부터 얻어졌다. SF 마커는 섬유아세포-유사 세포에서 발현되었고, 범-대식세포 마커는 대식세포-유사 세포에서 발현되었으며, 이는 대식세포-풍부 및 섬유아세포-풍부 분획이 각각 활막염 조직으로부터 분리되었음을 시사한다(도 3A,B).

대식세포의 순도를 확립하기 위해, 대식세포 및 다른 세포 유형에 대한 표면 단백질 마커를 유세포 분석에 의해 분석하였다. F4/80 및 CD11b는 대식세포 마커에, Ly6G는 호중구 마커에, CD3는 T 세포 마커6에 사용되었습니다. 게이팅 전략은 앞서 도시된 바와 같이사용되었다 6. 세포의 90% 이상이 CD45, CD11b 및 F4/80을 발현한 반면, Ly6G 및 CD3의 발현은 1% 미만이었습니다(그림 4).

그림 3: 세포 유형 특이적 마커의 mRNA 발현. (A) RT-qPCR에 의한 활막 대식세포(SM) 및 활막 섬유아세포(SF)에서 범대식세포 마커(Cd68, Emr1, Itgam, Csf1r)의 mRNA 발현(n=4). (B) SM 및 SF에서 SF 마커(Cdh11, Col6a1, Csf1, Vcam1)의 발현 수준(n = 4). 데이터는 평균± SD로 표시됩니다. **는 unpaired t-검정에 의해 p < 0.01을 나타냅니다. 데이터는 4개의 독립적인 실험으로부터 얻어졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 세포형 특이적 세포 표면 단백질 발현. 활막 대식세포(SM)에서 백혈구 표면 마커(CD45, CD11b, F4/80, Ly6g, CD3)의 유세포 분석에서 얻은 대표적인 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.