SVEM(Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Model)을 사용한 지질 나노입자(LNP) 제형 최적화를 위한 워크플로우

Summary

이 프로토콜은 실험 설계 구성에서 주관적인 선택을 최소화하는 혼합물, 연속 및 범주형 연구 요인에 대한 제형 최적화에 대한 접근 방식을 제공합니다. 분석 단계에서는 효과적이고 사용하기 쉬운 모델링 피팅 절차가 사용됩니다.

Abstract

우리는 과학자들에게 접근 가능한 워크플로우를 제공하는 것을 목표로 지질 나노입자(LNP) 제형을 최적화하기 위한 QbD(Quality by Design) 스타일의 접근 방식을 제시합니다. 이온화 가능, 헬퍼 및 PEG 지질의 몰 비율이 최대 100%까지 합산되어야 하는 이러한 연구의 고유한 제한 사항은 이러한 혼합물 제약 조건을 수용하기 위해 전문화된 설계 및 분석 방법이 필요합니다. LNP 설계 최적화에 일반적으로 사용되는 지질 및 공정 요인에 초점을 맞추고, 공간 충진 설계를 채택하고 최근 개발된 자체 검증 앙상블 모델(SVEM)의 통계적 프레임워크를 활용하여 혼합물 공정 실험의 설계 및 분석에서 전통적으로 발생하는 많은 어려움을 피할 수 있는 단계를 제공합니다. 후보 최적 제형을 생성하는 것 외에도 워크플로는 결과 해석을 단순화하는 적합 통계 모델의 그래픽 요약을 작성합니다. 새로 확인된 후보 제형은 확인 실행으로 평가되며 선택적으로 보다 포괄적인 2상 연구의 맥락에서 수행될 수 있습니다.

Introduction

생체내 유전자 전달 시스템을 위한 지질 나노입자 (LNP) 제형은 일반적으로 이온화 가능, 헬퍼 및 PEG 지질 ^1,2,3의 범주로부터 4개의 구성 지질을 포함한다. 이들 지질이 단독으로 연구되든 다른 비혼합물 인자와 동시에 연구되든, 이들 제형에 대한 실험은 "혼합물" 설계를 필요로 하는데, 그 이유는 - 후보 제형이 주어지면 - 지질 중 어느 하나의 비율을 증가시키거나 감소시키는 것은 필연적으로 다른 3개의 지질의 비율의 합에서 상응하는 감소 또는 증가로 이어지기 때문이다.

예를 들어, 현재 벤치마크로 취급될 세트 레시피를 사용하는 LNP 제형을 최적화하고 있다고 가정합니다. 목표는 LNP의 효능을 최대화하는 동시에 이차적으로 평균 입자 크기를 최소화하는 것입니다. 실험에서 다양한 연구 요소는 4가지 구성 지질(이온화 가능, 콜레스테롤, DOPE, PEG)의 몰비, N:P 비율, 유속 및 이온화 가능한 지질 유형입니다. 이온화 가능한 지질(콜레스테롤 포함)은 PEG보다 더 넓은 범위의 몰비(10-60%)에 걸쳐 변할 수 있으며, 이는 이 그림에서 1-5%로 ....

Protocol

대표 결과 섹션에 설명된 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었으며 절차는 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 수립한 지침에 따라 수행되었습니다. 6-8주령의 암컷 Balb/C 마우스를 상업적으로 입수하였다. 동물은 임의 표준 차우와 물을 받았고 40-60% 습도의 65-75°F(~18-23°C) 의 온도에서 12시간의 명암주기로 표준 조건에서 사육되었습니다.

1. 연구 목적, 반응 및 요인 기록

참고: 이 프로토콜 전체에서 JMP 17 Pro는 실험을 설계하고 분석하는 데 사용됩니다. 유사한 단계에 따라 동등한 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 섹션 1에서 수행된 모든 단계에 대한 예제 및 추가 지침은 보충 파일을 참조하십시오.

1. 날짜가 찍힌 문서에 실험의 목적을 요약합니다.
2. 실험 중에 측정할 1차 반응(CQA)을 나열합니다.
3. 측정할 수 있는 2차 반응(예: 물리화학적 특성에 대한 다운스트림 제한)을 나열합니다.
4. 연구 목적과 가장 관련이 있는 것을 포함하여 응답과 관련될....

Results

이 접근법은 광범위하게 분류된 지질 유형인 MC3 유사 고전적 지질 및 일반적으로 조합 화학에서 파생된 지질(예: C12-200)에 걸쳐 검증되었습니다. OFAT(One Factor at a Time) 분석법을 사용하여 개발된 벤치마크 LNP 제형과 비교했을 때, 당사의 워크플로우를 통해 생성된 후보 제형은 그림 18의 마우스 간 루시페라아제 판독값에 표시된 것과 같이 로그 척도에서 4-5배의 효능 향상을 자주 보여줍니다. 표 1 은 두 가지 최적화 단계(초기 연구 및 후속 연구)에 걸쳐 벤치마크 대조군 성능을 통해 관찰된 마우스 간 루시페라아제 발현의 상응하는 향상을 보여줍니다. 첫 번째 단계에서는 다른 요인을 일정하게 유지하면서 지질 비율을 최적화하는 데 중점을 두었습니다. 후속 연구에서는 추가적인 헬퍼 지질 유형을 도입하고 지질 비율 구성과 헬퍼 지질 유형을 모두 고려하여 최적화를 수행했습니다. 결과적으로, 새로 도입된 헬퍼 지질 유형이 .......

Discussion

혼합물 공정 실험의 설계 및 분석을 위한 최신 소프트웨어를 통해 과학자들은 비효율적인 OFAT 실험을 피하는 구조화된 워크플로우에서 지질 나노입자 제형을 개선할 수 있습니다. 최근에 개발된 SVEM 모델링 접근 방식은 이전에 불필요한 통계적 고려 사항으로 과학자들의 주의를 산만하게 했을 수 있는 많은 난해한 회귀 수정 및 모델 축소 전략을 제거합니다. 일단 결과가 수집되면, SVEM 분석 프레임워크는 구현하기 더 쉬우며 전통적인 모델링 접근법보다 더 나은 모델을 생성하는 경향이 있는 접근법을 제공한다¹³. 또한 각 반응에 대한 예측 공식을 기반으로 하는 그래픽 분석은 과학자들이 쉽게 해석할 수 있으며, 회귀 모델에서 상관관계가 높은 매개변수 추정치를 해석할 필요 없이 개별 요인 및 소규모 요인 그룹에 대한 반응의 한계 거동에 대한 명확한 요약을 제공합니다. 이를 통해 과학자들은 SVEM이 통계적으로 유의하지 않은 영향을 자동으로 제거한 후 연구 요인 전반에 걸쳐 실질적인 중요성을 평가하.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
JMP 프로 17.1	JMP 통계적 발견 LLC