여기에서 우리는 간 조직의 지질 액적 특성 분석을 위해 최적화된 BODIPY 493/503 형광 기반 프로토콜을 입증합니다. 직교 투영 및 3D 재구성의 사용을 통해 형광단은 미세소포와 대소포성 지방증 사이의 성공적인 구별을 가능하게 하고 간 지방증 평가를 위한 고전적인 조직학적 프로토콜에 대한 보완적인 접근 방식을 나타낼 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
지질 액적(LD)은 지질 저장을 매개하고 지방 독성을 억제하고 유리 지방산(FA)으로 인한 기능 장애를 예방하는 데 매우 중요한 역할을 하는 특수 세포 기관입니다. 간은 신체의 지방 대사에 중요한 역할을 하기 때문에 미세소포성 및 대수포성 간 지방증의 형태로 LD의 세포 내 축적에 의해 지속적으로 위협을 받고 있습니다. LD의 조직학적 특성 분석은 일반적으로 ORO(Oil Red O) 염색과 같은 지용성 디아조 염료를 기반으로 하지만 여러 가지 단점이 간 표본에서 이 분석을 사용하는 것을 지속적으로 방해합니다. 보다 최근에, 친유성 형광단 493/503은 중성 지질 액적 코어로의 빠른 흡수 및 축적으로 인해 LD를 시각화하고 위치를 찾는 데 널리 사용되었습니다. 대부분의 응용 분야가 세포 배양에서 잘 설명되어 있지만 조직 샘플에서 LD 이미징 도구로서 친유성 형광단 프로브의 신뢰할 수 있는 사용을 입증하는 증거는 적습니다. 여기에서 우리는 고지방 식이(HFD) 유발 간 지방증의 동물 모델에서 간 표본의 LD를 평가하기 위해 최적화된 BODIPY(boron dipyromethene) 493/503 기반 프로토콜을 제안합니다. 이 프로토콜은 간 샘플 준비, 조직 절개, BODIPY 493/503 염색, 이미지 획득 및 데이터 분석을 다룹니다. 우리는 HFD 수유 시 간 LD의 증가된 수, 강도, 면적 비율 및 직경을 보여줍니다. 직교 투영과 3D 재구성을 사용하여 LD 코어에서 중성 지질의 전체 함량을 관찰할 수 있었으며, 이는 거의 구형의 물방울로 나타났습니다. 또한, 형광단 BODIPY 493/503을 사용하여 미세소포(1μm 9μm)를 구별할 수 있어 미세소포 및 대수포성 지방증을 성공적으로 구별할 수 있었습니다. 전반적으로, 이 BODIPY 493/503 형광 기반 프로토콜은 간 LD 특성 분석을 위한 신뢰할 수 있고 간단한 도구이며 고전적인 조직학적 프로토콜에 대한 보완적인 접근 방식을 나타낼 수 있습니다.
서론
지질 방울(LD)은 일반적으로 에너지 저장소로 간주되며, 지질 저장을 매개하는 특수 세포 소기관이며, 인지질 단층 1,2,3에 의해 캡슐화된 콜레스테롤 에스테르와 트리글리세리드(TG)를 주로 포함하는 소수성 중성 지질 코어로 구성됩니다.
LD 생물 발생은 트리 아실 글리세롤 (TAG)과 스테롤 에스테르의 합성으로 시작하여 소포체 (ER)에서 발생합니다. 중성 지질은 낮은 농도에서 ER 이중층의 소엽 사이에서 확산되지만 세포 내 농도가 증가하면 ER 막에서 거의 구형의 물방울로 자라서 싹이 트는 오일 렌즈로 합쳐집니다4. 그 후, ER 이중층 및 세포질의 단백질, 특히 페리핀(PLIN) 단백질 패밀리는 LD의 표면으로 전위되어 출아를 촉진합니다 5,6,7,8,9.
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프로토콜
이 연구에서 수행된 모든 동물 절차는 코임브라 임상 및 생물 의학 연구 연구소(iCBR) 동물 복지 기구(ORBEA, #9/2018)의 승인을 받았으며 동물 관리 국가 및 유럽 지침과 ARRIVE 지침을 준수했습니다.
1. 실험 설계
- 온도(22°C ± 1°C), 습도(50%-60%) 및 빛(12시간 명암 주기)의 통제된 환경 조건에서 통풍이 잘되는 케이지에 있는 페어 하우스 13주 된 수컷 Wistar 쥐와 수돗물 및 표준 설치류 차우에 대한 임의적 접근.
- 2 주간의 순응 기간 후, 쥐를 임의로 두 그룹으로 나눕니다.
- 대조군(CTRL, n = 6)과 고지방 식단 그룹(HFD, n = 6)에 각각 표준 차우와 고지방 식단(45% kcal/지방)을 24주 동안 공급합니다.
- 매주 체중(BW)을 모니터링합니다. 케이지 당 매일 음식 및 음료 소비량을 기록하십시오.
2. 간 시료 전처리
- 간 해부
- 연동 펌프 준비: 튜브를 통해 70% 에탄올을 흐르게 하고 27G 바늘을 튜브의 출구 끝에 연결한 다음 얼음처럼 차가운(4....
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결과
이 기법을 성공적으로 실행하면 LD 형태(3D 재구성에 기반한 모양 및 지질 코어 밀도)의 동시 특성화와 공간 분포, 총 면적당 수 및 평균 크기(위에서 설명한 파이프라인으로 평가, 그림 1)를 위한 투명한 지질 액적 염색이 가능해야 합니다.
그림 1: CellProfiler를 사용한 샘플 이미지 처리 . (A) CTL 그룹에서.......
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토론
LD 평가를 위한 이 BODIPY 493/503 형광 기반 프로토콜은 간 지방증 평가를 위한 새로운 이미징 접근 방식을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 비만과 지방간 질환 사이의 강한 상관관계를 감안할 때, 간지방증의 동물 모델을 확립하기 위해 서양식 고지방 식단이 사용되었다26. 간 TG 함량의 강력한 증가는 정량적 트리글리세리드 비색 분석 키트에 의해 확인되었으며, 이는 HFD를 먹인 동물에서 간 지질증 시나리오가 높아졌음을 시사했습니다. 이어서, LD 축적 정도는 저배율 하에서 형광 프로브 BODIPY 493/503에 의해 시각화되었다. 예상대로 BODIPY 493/503 염색은 HFD 그룹의 간 조직 전체에 걸쳐 소포 구조의 광범위한 분포를 보여주었습니다. 직교 투영과 3D 재구성에 의존하여 LD 코어가 거의 구형의 물방울로 나타나는 중성 지질의 전체 함량을 나타내는 것을 관찰할 수 있었습니다. 또한, 전체 면적당 LD 면적의 강력한 증가가 분명하게 나타났으며(360% 대 CTL.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 포르투갈 과학 기술 재단(FCT), 유럽 지역 개발 기금(FEDER) 및 Programa Operacional Factores de Competitividade(COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020(CIBB) 및 POCI-01-0145-FEDER-007440을 통해 국가 및 유럽 기금의 지원을 받았습니다. 저자는 코임브라 대학교 의과대학 시설이자 국가 인프라 PPBI-Portuguese Platform of BioImaging(POCI-01-0145-FEDER-022122)의 회원인 iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab의 지원과 FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142의 지원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.6mm ID 실리콘 튜브, IV 미니 드립 세트 | Fisher Scientific | ||
| 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene 또는 | D1306 | |
| 70% 에탄올 | Honeywell | 10191455 | |
| 어도비 일러스트레이터 CC | 어도비 Inc. | 을 설계하는 데 사용 | |
| 자동 분석기 Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
| 배리어 펜 (액체 차단제 슈퍼 팝 펜) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
| Blade | Leica | 221052145 | cryostat |
| Cell Profiler 버전 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | 분석에 사용 획득된 이미지 | |
| Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
| Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
| Cryostat (검체 디스크 및 열 추출기 포함) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | 5mg/mL 원액의 Bodipy를 용해하는 데 사용됩니다. 주의 : 독성이 이며 가연성입니다. 증기는 자극을 유발할 수 있습니다. 흄 후드에서 조작하십시오. 피부와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 고무 장갑, 보호 눈 고글을 착용하십시오. |
| 드라이 아이스 용기 (스티로폼 쿨러) | Novolab | A26742 | |
| Dumont 펜치 | 파인 사이언스 툴, 독일 | 11295-10 | |
| 유리 페트리 접시 (H 25 mm, ø 150 mm) | Thermo Scientific | 150318 | 해부 후 간 무게를 측정하는 데 사용 |
| 글리세르겔 | DAKO Omnis | S303023 | |
| GraphPad Prism 소프트웨어, 버전 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
| 고지방 다이어트 | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
| 케타민(Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | 최종 농도 75 mg/kg에서 사용됨 |
| 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 (QUASAR 검출 장치; ) | Carl Zeiss, | 독일 LSM 710 Axio Observer Z1 현미경 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | 1 mg/kg의 최종 농도에서 사용 |
| 바늘 | BD 마이크로랜스 | 300635 | |
| No 15 멸균 탄소강 메스 블레이드 | Swann-Morton | 205 | |
| 대물렌즈 10x(Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x(Plan-Apochromat 20x/0.8) 및 40x(Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, 독일 | ||
| 페인트 브러시 | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | 냉동 절개 | |
| 연동 펌프(Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
| 메스 손잡이, 125mm(5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
| 슬라이드 염색 시스템 StainTray | Simport Scientific | M920 | |
| 표준 다이어트 | Mucedola | 4RF21 | |
| Superfrost Plus 현미경 슬라이드 | Menzel-Glaser, 독일 | J1800AMNZ | |
| Tissue-Tek OCT 장착 매체 | VWR CHEMICALS | 361603E | |
| 트리글리세리드 비색 분석 키트 | Cayman Chemical | 10010303 | |
| 초음파 욕조 | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
| Vannas 스프링 가위 - 3 mm cutting edge | Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
| ZEN Black software | Zeiss |
참고문헌
- Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
- Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews....
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재인쇄 및 허가
