뼈 조직 엔지니어링을 위한 탈세포화된 사과 유래 스캐폴드 , In Vitro 및 In Vivo

부상이나 질병으로 인한 큰 뼈 결손은 완전한 재생을 위해 생체재료 이식이 필요한 경우가 많습니다¹. 뼈 조직 재생을 개선하기 위해 고안된 현재의 기술은 정기적으로 자가 이식편, 동종 이식편, 이종 이식편 또는 합성 이식편을 사용합니다². 큰 뼈 결함을 복구하기 위한 "황금 표준" 이식 관행으로 간주되는 자가 뼈 이식의 경우 환자로부터 뼈를 추출합니다. 그러나 이 이식 절차에는 크기 및 모양 제한, 조직 가용성, 샘플링 부위 이환율 등 몇 가지 단점이 있습니다³. 또한, 자가 이식술은 수술 부위 감염, 후속 골절, 검체 채취 또는 재건 부위에서의 혈종 형성 및 수술 후 통증에 취약하다⁴. 뼈 조직 공학(BTE)은 기존의 뼈 이식 방법에 대한 잠재적인 대안을 제공합니다⁵. 구조적 생체 재료와 세포를 결합하여 새로운 기능적 뼈 조직을 만듭니다. BTE용 생체 재료를 설계할 때 거대 다공성 구조, 세포 부착을 촉진하는 표면 화학 및 천연 뼈와 매우 유사한 기계적 특성을 결합하는 것이 중요합니다⁶. 과거 연구에 따르면 BTE에 사용되는 생체 재료에 대한 이상적인 기공 크기 및 탄성 계수는 이식 부위에 따라 각각 약 100-200 μm⁷ 및 0.1-20 GPa입니다⁸. 또한, 지지체의 다공성 및 기공 상호 연결성은 세포 이동, 영양소 확산 및 혈관 신생에 영향을 미치는 중요한 요소입니다⁸.

BTE는 뼈 이식의 대안으로 개발 및 평가된 다양한 생체 재료로 유망한 결과를 보여주었습니다. 이러한 생체 재료 중 일부는 골유도 재료, 하이브리드 재료 및 고급 하이드로겔⁸입니다. 골유도성 물질은 새로 형성된 뼈 구조의 발달을 자극합니다. 하이브리드 재료는 합성 및/또는 천연 고분자(⁸)로 구성된다. 고급 하이드로겔은 세포외 기질(ECM)을 모방하며 뼈 조직 통합을 촉진하는 데 필요한 생체 활성 인자를 전달할 수 있습니다⁸. 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite)는 전통적인 재료이며 그 조성과 생체 적합성으로 인해 BTE에 일반적으로 선택된다⁹. 생체 활성 유리는 BTE의 또 다른 유형의 생체 재료로, 골형성에 필요한 유전자를 활성화하기 위해 특정 세포 반응을 자극하는 것으로 나타났습니다^10,11. 폴리(글리콜산) 및 폴리(젖산)를 포함한 생분해성 고분자도 BTE 응용 분야에서 광범위하게 사용되어 왔다¹². 마지막으로, 키토산, 키틴, 박테리아 셀룰로오스와 같은 천연 또는 자연 유래 폴리머도 BTE¹³에 대한 고무적인 결과를 보여주었습니다. 그러나 합성 고분자와 천연 고분자 모두 BTE의 잠재력을 보여주지만, 원하는 거대 구조를 가진 기능성 스캐폴드를 개발하려면 일반적으로 광범위한 프로토콜이 필요합니다.

반대로, 천연 거시적 셀룰로오스 구조는 다양한 식물에서 쉽게 유도할 수 있으며, 우리 연구 그룹은 이전에 식물에서 유래한 셀룰로오스 기반 스캐폴드를 다른 조직 재구성에 적용할 수 있음을 입증했습니다. 실제로, 간단한 계면활성제 처리 후, 우리는 식물 재료의 고유한 구조를 활용하여 다용도 생체 재료로서의 잠재력을 강조했습니다¹⁴. 더욱이, 이들 셀룰로오스-기반 스캐폴드는 시험관 내 포유류 세포 배양 응용(¹⁴)에 사용될 수 있고, 생체 적합성이 있으며, 자발적인 피하 혈관형성(spontaneous subcutaneous vascularization^{)을 지원한다(14,15,16,17}). 우리의 연구 그룹과 다른 사람들은 모두 이러한 스캐폴드가 의도된 응용 프로그램 14,15,16,17,18,19,20에 따라 특정 식물에서 얻을 수 있음을 입증했습니다. 예를 들어, 식물의 줄기와 잎에서 관찰되는 혈관 구조는 동물 조직에서 발견되는 구조와 현저한 유사성을 나타낸다¹⁹. 또한, 식물로부터 유래된 셀룰로오스 스캐폴드는 원하는 특성을 달성하기 위해 용이하게 형성되고 표면 생화학적 변형을 받을 수 있다(¹⁶). 최근 연구에서, 우리는 탈세포화 과정 동안 염 완충액을 통합하여, in vitro 및 in vivo 설정 모두에서 세포 부착을 향상시켰다¹⁶. 같은 연구에서 우리는 스캐폴드 표면에 하이드로겔을 주조하여 복합 생체 재료에서 식물 유래 셀룰로오스 스캐폴드의 적용 가능성을 입증했습니다. 최근 연구에서 식물 유래 스캐폴드의 기능화는 그 효과를 향상시키는 것으로 나타났습니다¹⁸. 예를 들어, Fontana et al. (2017)이 수행한 연구에 따르면 인간 피부 섬유아세포의 접착력은 RGD로 코팅된 탈세포화된 줄기에 의해 지지되는 반면, 코팅되지 않은 줄기는 동일한 기능을 나타내지 않는 것으로 나타났습니다¹⁸. 또한, 저자들은 변형된 모의 체액을 사용하여 탈세포화된 식물 줄기를 인위적으로 광물화할 수 있음을 입증했습니다. 보다 최근의 연구에서, 우리는 식물 유래 셀룰로오스 스캐폴드에서 기계에 민감한 골 형성의 개념을 탐구하고 BTE^17,20에 대한 잠재력을 평가했습니다. 또한, Lee et al. (2019)은 식물 유래 스캐폴드를 활용하여 체외 환경에서 뼈와 유사한 조직을 배양했습니다²¹. 다양한 식물 공급원에 대한 포괄적인 평가를 통해 저자들은 사과 유래 스캐폴드가 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)의 배양 및 분화에 가장 적합하다는 것을 확인했습니다. 또한 저자들은 사과에서 추출한 비계의 구조적, 기계적 특성이 의도한 목적에 대한 적합성에 중추적인 역할을 한다고 제안했습니다. 조직 공학 응용 분야에서 구현된 초기 식물 유래 지지체인 사과 유래 지지체는 특히 직경 100에서 200μm에 이르는 상호 연결된 기공 측면에서 인간 뼈의 구조와 현저하게 유사한 구조를 갖는 것으로 광범위하게 나타났습니다(^14,21).

본 연구에서 우리는 BTE에 대한 사과 유래 셀룰로오스 스캐폴드의 잠재력을 추가로 조사하고 시험관 내 및 생체 내 모두에서 기계적 특성을 분석했습니다. BTE 17,20,21에 대한 사과 유래 스캐폴드의 잠재력에 대한 연구가 있었지만 기계적 특성은 충분히 조사되지 않았습니다. 결과는 분화 배지에서 4주 동안 배양된 스캐폴드에 파종된 MC3T3-E1 전골아세포의 야생 확산 침입 및 골형성 분화를 보여주었습니다. 이 스캐폴드의 영률은 192.0 ± 16.6 kPa였으며, 이는 빈 스캐폴드(시드된 세포가 없는 스캐폴드)(31.6 ± 4.8 kPa) 및 비분화 배지에서 배양된 셀 시드 스캐폴드(24.1 ± 8.8 kPa)보다 훨씬 높았습니다. 그러나, 건강한 인간 뼈 조직의 영률(Young's modulus)은 전형적으로 섬유주 뼈의 경우 0.1-2 GPa, 피질골의 경우 약 15-20 GPa의 범위 내에 속한다는 점에 유의해야 한다⁸. 그럼에도 불구하고, 설치류의 종골 결손에서 8주간의 착상 후, 세포 파종된 지지체는 주변 뼈에 잘 통합된 것으로 나타났으며, 이는 푸시아웃 테스트에서 평균 113.6N ± 18.2N의 피크 힘으로 입증되었으며, 이는 이전에 보고된 본래 종아리골²²의 골절 하중과 유사하다. 전반적으로, 이 연구에서 얻은 결과는 특히 비하중 응용 분야에서 상당한 가능성을 보여줍니다. 그러나 사과 유래 셀룰로오스 스캐폴드는 현재 임플란트 부위의 주변 뼈 조직과 정확하게 일치하는 데 필요한 기계적 특성을 가지고 있지 않습니다. 따라서 이러한 스캐폴드의 잠재력을 최대한 활용하려면 추가 개발이 필요합니다.

실험 프로토콜은 오타와 대학교 동물 보호 위원회(University of Ottawa Animal Care Committee)에서 검토하고 승인했습니다.

1. 비계 준비

1. 만돌린 슬라이서를 사용하여 매킨토시 사과(Canada Fancy)를 8mm 두께로 자릅니다. 사과 조각의 히판티움 조직을 5mm x 5mm 정사각형으로 자릅니다.
2. 정사각형 샘플을 0.1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)에 2일 동안 넣습니다.
3. 탈셀룰라화된 샘플을 탈이온수로 세척하고 실온(RT)에서 100mM_CaCl2의 밤새 배양하여 나머지 계면활성제를 제거합니다.
4. 샘플(즉, 스캐폴드)을 70% 에탄올로 30분 동안 멸균하고 탈이온수로 세척한 다음 세포 파종 전에 24웰 배양 플레이트에 넣습니다.

2. 세포 배양 및 스캐폴드 파종

1. 세포 배양 조건(95% 공기 및 5%_CO2의 가습 분위기에서 37°C)에서 10cm 직경의 세포 배양 처리 접시에 MC3T3-E1 Subclone 4 세포를 유지합니다.
2. 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Eagle의 최소 필수 배지인 알파 변형(α-MEM)으로 만든 세포 배양 배지를 준비합니다.
3. 80% 밀도에 도달하면 트립신화(0.05% 트립신-EDTA)를 통해 배양 접시에서 세포를 분리합니다.
4. 셀 현탁액을 ca 200 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 mL당 2.5 x 10⁷ 세포에서 α-MEM에 세포를 재현탁시킵니다.
5. 스캐폴드 표면에 세포 현탁액의 40μL 분취액을 피펫팅하고 세포 배양 조건에서 세포가 1시간 동안 부착되도록 합니다. 그 후, 배양 플레이트의 각 배양 웰에 배양 배지 2mL를 추가합니다.
6. 14일 동안 2-3일마다 배양 배지를 보충합니다.
7. 앞서 설명한 세포 배양 배지에 50μg/mL 아스코르브산 및 4mM 인산나트륨을 첨가하여 분화 배지를 준비합니다.
8. MC3T3-E1 세포를 분화 배지에서 4주 동안 배양하여 분화를 유도합니다. 3-4일마다 배지를 보충하십시오. 이와 병행하여, 동일한 배지 교체 일정으로 동일한 기간 동안 비분화 배양 배지(즉, 분화를 유도하기 위한 보충제가 없는 배지)에서 스캐폴드를 배양하여 음성 대조군 역할을 합니다.

3. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용한 기공 크기 측정

1. 탈세포화된 사과 유래 스캐폴드를 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다.
2. 10%(v/v) calcofluor white stain 1mL의 스캐폴드를 RT의 어두운 곳에서 25분 동안 배양합니다.
3. PBS로 스캐폴드(n = 3)를 세척하고 다음과 같이 DAPI 채널을 사용하여 10x 배율로 고속 공진 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)으로 스캐폴드당 무작위로 선택된 3개의 영역을 이미지화합니다.
   1. 레이저 방출 필터 구성: 405nm(레이저); 425-475 nm (방출)
   2. 최적의 이미지 획득을 보장하기 위해 레이저 출력과 검출기를 수동으로 조정합니다. 5μm 스텝 크기로 20개 이미지의 z 스택을 획득합니다.
4. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 다음과 같이 공초점 이미지를 처리하고 분석합니다.
   1. Z-투영을 최대 강도로 설정 기능을 사용하여 이미지를 생성하고, 가장자리 찾기 기능을 적용하여 모공의 가장자리를 강조 표시합니다.
   2. 자유형 선택 도구를 사용하여 모공을 수동으로 추적합니다.
   3. 각 기공을 타원으로 맞추고, 장축의 길이를 측정하고, 모든 측정값을 컴파일하고(본 연구에서 총 54개 - 각 스캐폴드에 대해 무작위로 선택된 3개 영역에서 6개) 평균 길이를 계산합니다.

4. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 이용한 세포 분포 분석

1. 비분화 또는 분화 배지에서 배양된 세포 시드 스캐폴드를 PBS로 3회 세척합니다. 4% 파라포름알데히드로 스캐폴드를 10분 동안 고정합니다.
2. 각 스캐폴드를 탈이온수로 철저히 세척하고 Triton-X 100 용액으로 5분 동안 세포를 투과시킨 다음 PBS로 다시 세척합니다.
3. 스캐폴드를 1% 주기산 1mL에 40분 동안 배양하고 탈이온수^14,16으로 헹굽니다.
4. 100μg/mL 요오드화 프로피듐이 보충된 100mM 메타중아황산나트륨과 0.15M 염산을 함유한 용액 1mL에 스캐폴드를 배양합니다. 비계를 용액에 완전히 담그십시오.
5. PBS로 스캐폴드를 세척하고 어둠 속에서 5mg/mL DAPI 용액에 10분 동안 스캐폴드를 배양하여 세포핵을 염색합니다. 이미징 전에 다시 철저히 세척하고 스캐폴드를 PBS에 보관하십시오.
6. 다음과 같이 DAPI 및 TRITC 채널을 사용하여 10x 배율의 고속 공진 CLSM으로 3개의 서로 다른 셀 시드 스캐폴드의 무작위로 선택된 3개의 표면을 이미지화합니다.
   1. 레이저 방출 필터 구성:
      DAPI: 레이저: 405nm; 방출: 425-475nm
      TRITC: 레이저: 561nm; 방출: 570-620nm
   2. 최적의 이미지 획득을 보장하기 위해 레이저 출력과 검출기를 수동으로 조정합니다. 5μm 스텝 크기로 20개 이미지의 z 스택을 획득합니다.
7. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 컨포칼 이미지를 처리하고 Z-Project to Maximum Intensity 기능을 사용하여 이미지 분석을 위한 z축의 최대 투영을 생성합니다.

5. 알칼리성 인산가수분해효소 분석

1. 비분화 또는 분화 배지에서 배양된 세포 시드 스캐폴드를 PBS로 3회 세척합니다. 10% 중성 완충 포르말린으로 지지대를 30분 동안 고정합니다. 빈 스캐폴드(시드된 셀이 없는 스캐폴드)를 음극 대조군 역할을 하도록 고정합니다.
2. 10mL의 탈이온수에 BCIP/NBT 정제 1개를 용해시켜 5-브로모-4-클로로-3'-인돌리포스페이트 및 니트로-블루 테트라졸륨(BCIP/NBT) 염색 용액을 준비합니다.
3. 고정 스캐폴드를 0.05% 트윈 용액으로 세척하고 BCIP/NBT 용액으로 RT에서 20분 동안 염색합니다. 염색된 스캐폴드를 0.05% 트윈 용액으로 세척하고 이미징 전에 PBS에 보관합니다.
4. 12 메가 픽셀 디지털 카메라로 얼룩진 비계를 이미지화하십시오.

6. 칼슘 침착 분석

1. 비분화 또는 분화 배지에서 배양된 세포 시드 스캐폴드를 PBS로 3회 세척합니다. 10% 중성 완충 포르말린으로 지지대를 30분 동안 고정합니다. 빈 스캐폴드(시드된 셀이 없는 스캐폴드)를 음극 대조군 역할을 하도록 고정합니다.
2. 2%(w/v) alizarin red S(ARS) 염색액을 준비합니다.
3. 고정 스캐폴드를 탈이온수로 세척하고 RT에서 1시간 동안 ARS 용액으로 염색합니다. 염색된 스캐폴드를 탈이온수로 세척하고 이미징 전에 PBS에 보관합니다.
4. 12 메가 픽셀 디지털 카메라로 얼룩진 비계를 이미지화하십시오.

7. 광물화 분석

1. 비분화 또는 분화 배지에서 배양된 세포 시드 스캐폴드를 PBS로 3회 세척합니다. 4 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 비계를 고정하십시오. 빈 스캐폴드(시드된 셀이 없는 스캐폴드)를 음극 대조군 역할을 하도록 고정합니다.
2. 앞서 설명한 바와 같이 50%에서 100%로 증가하는 에탄올 농도를 포함하는 용액에서 샘플을 탈수합니다²³.
3. 주사전자현미경(SEM) 및 에너지분산분광법(EDS)을 수행하여 다음과 같이 광물 응집체를 분석합니다.
   1. 제조업체의 프로토콜²⁴에 따라 임계점 건조기를 사용하여 샘플을 건조합니다.
   2. 제조업체의 프로토콜²⁵에 따라 골드 스퍼터 코터를 사용하여 스캐폴드에 5nm 골드 코트를 적용합니다.
   3. 85x 배율로 3kV로 설정된 주사 전자 현미경으로 스캐폴드의 표면을 이미지화합니다.
   4. 주사전자현미경을 15kV로 설정하여 EDS를 수행합니다. 스캐폴드당 무작위로 선택된 3개 영역에서 광물 응집체 조성 분석을 위한 EDS 스펙트럼을 획득합니다.

8. 영률 측정

1. 각각의 배양 배지에서 세포 시드 스캐폴드를 제거하고 즉시 샘플을 테스트합니다.
2. 1.5 N 로드셀이 장착된 맞춤형 단축 압축 장치를 사용하여 3mm·^min-1 의 일정한 속도로 스캐폴드(조건당 n = 3)를 스캐폴드 높이의 10%의 최대 압축 변형률로 압축합니다.
3. 응력-변형률 곡선의 선형 부분의 기울기에서 영률(Young's modulus)을 결정합니다. 본 연구에서 탄성계수는 9%에서 10% 변형률 사이에서 측정되었습니다.

9. 조직학에 의한 세포 침투 및 광물화 분석: In vitro scaffolds

1. 비분화 또는 분화 배지에서 배양된 세포 시드 스캐폴드를 PBS로 3회 세척합니다.
2. 세포 파종 스캐폴드를 4% 파라포름알데히드로 48시간 동안 고정한 후 보관을 위해 70% 에탄올에 다시 현탁시킵니다.
3. 조직학:
   참고: 본 연구에서 다음 단계에서 설명된 전체 조직학적 준비(임베딩, 절편 및 염색)는 Louise Pelletier Histology Core Facility(University of Ottawa)에서 수행했습니다.
   1. 탈수 및 파라핀에 담근 후 샘플을 스캐폴드 내부 1mm에서 시작하여 5μm 두께의 연속 섹션으로 자르고 현미경 슬라이드에 섹션을 장착합니다.
   2. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 또는 폰 코사(VK) 염색으로 절편을 염색합니다.
   3. 슬라이드 스캐너 현미경으로 40x 배율로 단면을 이미지화합니다(본 연구에서 비분화 매질에서 n = 1개의 스캐폴드, 분화 매질에서 n = 2개의 스캐폴드).
   4. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 세포 침투(H&E 염색) 및 광물화(VK 염색)를 육안으로 평가할 수 있습니다.

10. 쥐 석회질 결함 모델

1. 지역 동물 관리 위원회에서 실험 프로토콜을 검토하고 승인합니다.
2. 위에서 설명한 섹션 1에 따라 5mm 생검 펀치를 사용하여 원형(직경 5mm 및 두께 1mm) 탈세포 스캐폴드를 준비합니다.
3. 다음과 같이 확립된 프로토콜²⁶에 따라 양측 개두술을 수행합니다.
   1. 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 이소플루란으로 마취시키는데, 처음에는 의식을 잃을 때까지 3%에서 마취한 다음 절차 내내 2-3%에서 마취합니다.
   2. 메스 칼날을 사용하여 위에 있는 피부를 절단하여 골막과 두개골을 노출시킵니다. 골막을 제거합니다.
   3. 0.9% NaCl의 지속적인 세척 하에 직경 5mm의 트레핀이 장착된 치과용 드릴을 사용하여 시상 봉합사의 양쪽에 있는 양쪽 정수리 뼈에 양측 결손을 만듭니다.
   4. 0.9% NaCl로 주변 뼈를 청소하여 뼈 조각을 제거합니다.
   5. 원형의 탈세포화된 지지체를 결함에 배치합니다.
   6. 4-0 봉합사로 덮인 피부를 닫습니다.
4. 쥐에게 음식과 물을 무제한으로 제공하고 매일 모니터링하십시오.
5. 이식 후 8주 후, 2차 안락사 조치로_CO2 흡입 및 흉부 천공으로 쥐를 안락사시킵니다.
6. 두개골을 노출시키고 임플란트를 회수하려면 메스 칼날을 사용하여 두개골을 덮고 있는 피부를 제거합니다.
7. 치과 드릴을 사용하여 전두골과 후두골, 양쪽 두정골 측면의 두개골을 절단하여 두개골의 윗부분을 완전히 제거합니다.

11. 밀어내기 시험

1. 단축 압축 디바이스(445 N 로드셀 포함)를 USB 데이터 수집 모듈에 연결합니다.
2. 데이터 수집 모듈을 데이터 수집 소프트웨어 어플리케이션이 장착된 컴퓨터에 연결합니다.
3. 두개골 적출 직후, 각 샘플(본 연구에서 4마리의 동물에서 채취한 n = 7개의 임플란트)을 뼈의 등쪽이 위를 향하도록 단축 압박 장치의 샘플 홀더에 놓습니다.
4. 추출한 임플란트에 약간 닿을 때까지 플런저를 0.5mm/min으로 내립니다.
5. 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 0.5mm/min의 일정한 속도로 압축을 적용하면서 완전히 밀려날 때까지 플란트를 통해 플런저를 내려 테스트를 시작합니다.
6. 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 힘 대 변위 곡선의 피크 힘을 기록하십시오.

12. 조직학에 의한 세포 침투 및 광물화 분석: In vivo scaffolds

1. 추출된 칼바리아를 고정하고 10% 중성 완충 포르말린에 72시간 동안 이식한 후 보관을 위해 70% 에탄올에 다시 현탁시킵니다.
2. 조직학:
   참고: 본 연구에서 다음 단계에서 설명된 모든 조직학적 준비(임베딩, 절편 및 염색)는 Accel Labs(몬트리올, QC, 캐나다)에서 수행했습니다.
   1. 샘플(메틸 메타크릴레이트에 삽입됨)을 6μm 두께의 세 가지 수준(상단, 하단 및 중앙)으로 절단하고 현미경 슬라이드에 장착합니다.
   2. H&E 또는 Masson-Goldner의 삼색(MGT)으로 섹션을 염색합니다.
3. 슬라이드 스캐너 현미경으로 40x 배율로 단면을 이미지화합니다(본 연구에서는 2마리의 동물에서 4개의 외식).
4. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 세포 침투(H&E 염색) 및 콜라겐 침착(MGT 염색)을 육안으로 평가합니다.

공극 크기 측정, 세포 분포 및 체외 광물화(그림 1 및 그림 2)
사과 조직 스캐폴드의 네이티브 세포 구성 요소를 완전히 제거하는 것은 스캐폴드를 SDS 및 CaCl2 로 처리한 후 달성되었습니다(그림 1A). 스캐폴드는 매우 다공성 구조를 나타냈으며, 이는 컨포칼 현미경을 사용하여 확인되었습니다. 이미지의 정량화는 154μm ± 40μm의 평균 공극 크기를 보여주었습니다. 공극 크기 분포는 73μm에서 288μm 사이였습니다. 그러나 대부분의 기공은 100μm에서 200μm 사이였습니다(그림 1C).

분화 배지에서 4주간의 배양 기간을 거친 후, 세포 시드 스캐폴드는 광범위한 백색 광물 침전물을 나타냈습니다(그림 1A). 세포를 포함하는 스캐폴드는 불투명한 흰색을 보였는데, 이는 빈 스캐폴드(시드된 세포가 없는 스캐폴드)에서는 관찰되지 않은 광물화를 시사합니다. 또한 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용한 분석은 스캐폴드 내에서 균일한 세포 분포를 보여주었습니다(그림 1B).

세포가 파종되거나 파종되지 않은 스캐폴드를 BCIP/NBT 및 ARS로 염색하여 각각 ALP 활성과 광물화를 분석했습니다(그림 1D). BCIP/NBT 염색은 빈 스캐폴드 또는 비분화 배지에서 배양된 세포 시드 스캐폴드와 달리 분화 배지에서 배양된 세포 시드 스캐폴드 내에서 ALP 활성(강한 보라색으로 표시)의 상당한 증가를 보여주었습니다. 마찬가지로, 분화 배지에서 배양된 세포 시드 스캐폴드는 ARS로 염색할 때 더 강렬한 붉은 색을 나타냈으며, 이는 빈 스캐폴드 또는 비분화 배지에서 배양된 세포 시드 스캐폴드에 비해 더 큰 광물화를 나타냅니다. 백그라운드 염색은 빈 스캐폴드에서 관찰되었는데, 이는 잠재적으로 탈세포화 프로토콜에 CaCl2 가 존재하기 때문입니다.

세포 침투 및 광물화를 분석하기 위해 스캐폴드에서 염색(H&E 및 VK)을 수행했으며 SEM 및 EDS를 사용하여 광물화를 추가로 평가했습니다(그림 2). H&E 염색(그림 2A)은 비분화 또는 분화 배지에서 배양된 세포 시드 스캐폴드에서 양호한 세포 침투를 보여주었습니다. 여러 개의 핵이 주변부와 비계 전체에 걸쳐 보였다. 콜라겐의 존재는 옅은 분홍색의 비계에서도 관찰되었습니다. 또한, 분화 배지에서 4주 배양 후 스캐폴드에 수행된 VK 염색은 기공 벽이 염색된 반면, 칼슘 침전물은 비분화 배지에서 배양된 스캐폴드에서 기공 벽의 바깥쪽 가장자리를 따라 단독으로 검출되었으며 탈세포화 처리 중 칼슘 흡수로 인해 발생할 수 있음을 보여주었습니다. 분화 배지에서 4주 동안 배양한 세포 시드 스캐폴드 표면의 국부적인 광물화는 SEM 분석으로 관찰되었습니다(그림 2B). 보다 구체적으로, 스페로이드 응집체와 유사한 광물 침전물이 기공 주변에서 관찰되었습니다. 대조적으로, 비분화 배지에서 4주 동안 배양된 빈 스캐폴드 또는 세포 시드 스캐폴드에서는 미네랄 응집체가 관찰되지 않았습니다. 인(P) 및 칼슘(Ca)에 해당하는 뚜렷한 특징적인 피크가 선택된 관심 영역의 EDS 스펙트럼, 특히 분화 배지에서 4주 동안 배양된 세포 시드 스캐폴드에서 관찰된 광물 침전물에서 관찰되었습니다(그림 2B).

체외 생체역학 분석(그림 3)
세포 시드 스캐폴드의 영률(Young's modulus)은 비분화 또는 분화 배지(각 실험 조건에 대해 n=3)에서 4주간의 배양 후 측정되었습니다. 이는 빈 스캐폴드(시드된 세포가 없는 스캐폴드)의 영(Young)의 계수(modulus)와 비교되었습니다(그림 3). 빈 스캐폴드(31.6 kPa ± 4.8 kPa)와 비분화 배지(24.1 kPa ± 8.8 kPa; p = 0.88)입니다. 대조적으로, 블랭크 스캐폴드의 모듈러스(31.6 kPa ± 4.8 kPa)와 분화 배지에서 배양된 세포 시드 스캐폴드의 모듈러스(192.0 kPa ± 16.6 kPa; p < 0.001)입니다. 또한, 비분화 및 분화 배지에서 배양된 세포 시드 스캐폴드의 영률(Young's moduli) 사이에 유의한 차이(p < 0.001)가 관찰되었습니다. 보충 그림 1 은 영률 계산에 대한 일반적인 응력-변형률 곡선을 보여줍니다.

생체 내 생체 역학적 성능 및 뼈 재생(그림 4 및 그림 5)
외과적 개두술은 총 6마리의 Sprague-Dawley 쥐에 대해 수행되었습니다. 트레핀 버를 사용하여 두개골의 양쪽 두정골에 양측 5mm 직경의 결손이 생성되었고, 종자 세포가 없는 사과 유래 셀룰로오스 지지체가 종아리 결손에 이식되었습니다(그림 4A). 이식 8주 후, 동물들은 안락사되었고, 두개골의 윗부분을 채취하여 기계적 검사 또는 조직학적 분석을 위해 처리했다.

육안 평가에 따르면, 지지대는 두개골 주변 조직에 잘 통합되어 있는 것으로 보였다. 기계적 푸시 아웃 테스트는 호스트 calvaria에서 스캐폴드의 통합(n = 7)을 정량적으로 평가하기 위해 수행되었습니다. 측정은 동물의 안락사 직후 단축 압축 장치(그림 4B)를 사용하여 수행되었습니다. 그 결과 피크 힘은 113.6N ± 18.2N인 것으로 나타났습니다(표 1).

이식된 지지체 내에서 세포 침투 및 세포외 기질의 침착을 평가하기 위해 조직학적 분석을 수행했습니다(그림 5). H&E 염색은 비계 기공 내의 세포 침투와 비계 내 혈관의 존재로 나타난 바와 같이 혈관화의 증거를 보여주었습니다. 또한 MGT 염색은 스캐폴드 내에 콜라겐이 존재함을 입증했습니다.

그림 1: 스캐폴드 이미지, 공극 크기 분포 및 in vitro mineralization. (A) 본래 세포와 계면활성제를 제거한 후 사과 유래 셀룰로오스 지지체(왼쪽)와 골형성 분화 배지에서 4주 배양 후 MC3T3-E1 세포로 파종한 지지체의 대표 사진(오른쪽). 눈금 막대는 2mm를 나타냅니다. (B) 비분화 배지("ND") 또는 골형성 분화 배지("D")에서 4주 동안 배양한 후 사과 유래 셀룰로오스 스캐폴드의 씨 세포를 보여주는 대표적인 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 이미지. 눈금 막대는 50μm를 나타냅니다. 프로필듐 요오드화물을 사용하여 셀룰로오스(빨간색)에 대한 스캐폴드와 DAPI를 사용하여 세포핵(파란색)에 대한 염색을 스캐폴드에서 수행했습니다. (C) MC3T3-E1 세포로 파종되기 전에 공초점 이미지의 z축에서 탈세포화된 사과 유래 셀룰로오스 스캐폴드의 기공 크기 분포. 분석은 3개의 서로 다른 스캐폴드에서 총 54개의 기공(스캐폴드당 무작위로 선택된 3개의 관심 영역에 있는 6개의 기공)에 대해 수행되었습니다. (D) 알칼리성 인산가수분해효소(ALP) 활성을 평가하기 위해 5-브로모-4-클로로-3'-인돌리포스페이트와 니트로-블루 테트라졸륨(BCIP/NBT)으로 염색하고 칼슘 침착을 시각화하기 위해 알리자린 레드 S(ARS)로 염색한 스캐폴드의 대표 이미지(눈금 막대 = 2mm - 모두에 적용). "블랭크"(시드된 세포가 없는 스캐폴드)로 표시된 스캐폴드는 BCIP/NBT로 염색되지 않았으며, 이는 ALP 활성이 없음을 나타냅니다. 반면에, 분화 배지("D")에서 배양된 세포 씨드 스캐폴드는 비분화 배지("ND")에서 배양된 세포 시드 스캐폴드에 비해 더 강렬한 파란색으로 표시된 더 높은 ALP 활성을 나타냈습니다. ARS 염색의 경우, 비분화 배지("ND")에서 배양된 빈 스캐폴드와 스캐폴드 모두 분화 배지("D")에서 배양된 스캐폴드에 비해 더 밝은 빨간색 음영을 나타냈습니다. 분화 배지("D")에서 배양된 스캐폴드에서 칼슘 침착의 존재는 강렬한 짙은 적색으로 설명되었습니다. 각 분석은 3개의 서로 다른 스캐폴드(n=3)에서 수행되었습니다. 이 그림은 Leblanc Latour (2023)27의 허가를 받아 각색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 체외 지지체의 조직학, 주사전자현미경(SEM) 및 에너지 분산 분광법(EDS) 분석. (A) 스캐폴드의 상단 조직학적 단면의 대표 이미지. 파라핀이 포매된 스캐폴드를 5μm 두께의 섹션으로 절단하고 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하여 세포 침투를 시각화하거나 von Kossa(VK)로 염색하여 스캐폴드 내의 광물화를 시각화했습니다. 스캐폴드는 MC3T3-E1 세포로 침윤되었으며, 이는 스캐폴드 주변부와 스캐폴드 전체에서 볼 수 있는 청색(핵) 및 분홍색(세포질) 염색으로 나타났습니다. 콜라겐(옅은 분홍색)도 볼 수 있었습니다("H&E - D"의 확대 삽입). 광물화는 비분화 배지("ND")에서 배양된 스캐폴드의 공극 벽 주변에서만 관찰되었습니다. 분화 배지("D")에서 배양된 스캐폴드의 공극 벽은 완전히 검은색으로 염색되었습니다. 분석은 비분화 배지("ND")에서 배양된 하나의 스캐폴드와 분화 배지("D")에서 배양된 2개의 스캐폴드에서 수행되었습니다(저배율 사진의 경우 스케일 바 = 1mm, 고배율 사진의 경우 스케일 바 = 50μm). (B) SEM 및 EDS 스펙트럼으로 얻은 대표적인 현미경 사진. 스캐폴드는 금으로 스퍼터 코팅을 거쳤고 3.0kV의 전압에서 전계 방출 주사 전자 현미경을 사용하여 이미지화되었습니다(스케일 바 = 100μm - 모두 적용). EDS 스펙트럼은 각 스캐폴드에서 획득되었습니다. 인(2.013keV) 및 칼슘(3.69keV) 피크는 각 EDS 스펙트럼에 표시됩니다. SEM과 EDS는 모두 세 개의 서로 다른 스캐폴드에서 수행되었습니다. 공백: 시드된 셀이 없는 스캐폴드. 이 그림은 Leblanc Latour (2023)27의 허가를 받아 각색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 비분화 배지("ND") 또는 분화 배지("D")에서 4주 동안 배양한 후 체외 스캐폴드의 Young's moduli. 데이터는 각 조건에 대한 3개의 반복실험 표본의 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표시됩니다. 통계적 유의성(*는 p<0.05를 나타냄)은 일원 분산 분석(ANOVA) 및 Tukey 사후 검정을 사용하여 결정되었습니다. 공백: 시드된 셀이 없는 스캐폴드. 이 그림은 Leblanc Latour (2023)27의 허가를 받아 각색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 이식 전 스캐폴드 사진 및 이식 8주 후 밀어내기 테스트: (A) 이식 전 스캐폴드의 대표 사진; (B) 푸시 아웃 시험에 사용되는 단축 압축 장치로, 로드셀은 별표(*)로 표시되고 샘플은 화살표로 표시됩니다. 이 그림은 Leblanc Latour (2023)27의 허가를 받아 각색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: in vitro scaffolds의 조직학 분석. 이식 8주 후 시드되지 않은 지지체의 조직학적 단면의 대표 이미지. 절편은 세포를 시각화하기 위해 헤마톡실린과 에오신(H&E) 또는 콜라겐을 시각화하기 위해 Masson-Goldner의 삼색(MGT)으로 염색되었습니다. 화살표는 적혈구를 나타냅니다. 콜라겐의 존재가 보입니다(눈금 막대 = 왼쪽 및 오른쪽 삽입물에 대해 각각 1mm 및 200μm). 이 그림은 Leblanc Latour (2023)27의 허가를 받아 각색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 푸시아웃 테스트에서 측정된 피크 힘.

보충 그림 1: 영률 계산을 위한 일반적인 응력-변형률 곡선. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

이해 상충 진술 : M.L.L, M.T. R.J.H., C.M.C., I.C. 및 A.P.는 BTE 응용 분야를 위한 식물 유래 셀룰로오스의 사용과 관련하여 오타와 대학교와 Spiderwort Inc.가 제출한 특허 출원에 대한 발명자입니다. M.L.L., R.J.H., C.M.C. 및 A.P.는 Spiderwort Inc.의 재정적 지분을 보유하고 있습니다.