이 프로토콜은 고도로 분화되고 편광된 인간 망막 색소 상피(RPE) 배양에서 리포푸신 축적 모델과 RPE의 총 OS 소비/분해 용량을 검출하기 위한 개선된 외부 세그먼트(OS) 식균 작용 분석을 설명합니다. 이러한 방법은 이전 리포푸신 모델과 고전적인 펄스 추적 외부 세그먼트 식균 작용 분석의 한계를 극복합니다.
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방법 논문
Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures
이 논문에서
요약
초록
망막 색소 상피(RPE)에 의한 광수용체 외부 세그먼트의 일일 식균 작용은 리포푸신(lipofuscin)이라고 하는 세포 내 노화 색소의 축적에 기여합니다. 리포푸신의 독성은 가장 흔한 유전성 망막변성인 스타가르트병에서 잘 알려져 있지만, 선진국에서 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인인 연령 관련 황반변성(AMD)에서 더 논란의 여지가 있습니다. 인간에서 리포푸신 독성을 결정하는 것은 어려웠으며 Stargardt의 동물 모델은 독성이 제한적이었습니다. 따라서 생체 내에서 인간 RPE를 모방하는 시험관 내 모델은 리포푸신 생성, 제거 및 독성을 더 잘 이해하는 데 필요합니다. 현재까지 대부분의 세포 배양 리포푸신 모델은 세포주에 있었거나 전체 광수용체 외부 세그먼트의 단편/팁이 아닌 복합 리포푸신 혼합물의 단일 성분을 RPE에 공급하여 보다 완전하고 생리학적인 리포푸신 모델을 생성했습니다. 여기에 기술된 것은 고도로 분화된 일차 인간 산전 RPE(hfRPE) 및 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 RPE에서 리포푸신 유사 물질(소화되지 않는 자가형광 물질, 또는 UAM으로 명명됨)의 축적을 유도하는 방법이다. 식균 작용을 통해 RPE에 의해 흡수된 자외선 처리된 OS 단편의 반복 공급에 의해 배양에 축적된 UAM. UAM이 생체 내에서 리포푸신과 유사하고 다른 주요 방법도 논의됩니다. 이 리포푸신 유사 축적 모델과 함께 UAM 과립의 광범위한 자가형광 스펙트럼을 동시 항체 염색과 구별하는 이미징 방법이 도입되었습니다. 마지막으로, RPE 식균 작용 능력에 대한 UAM의 영향을 평가하기 위해 외부 세그먼트 조각/팁 흡수 및 분해를 정량화하는 새로운 방법이 도입되었습니다. "총 소비 용량"이라고 하는 이 방법은 고전적인 외부 세그먼트 "펄스 추적" 분석에 내재된 RPE 식균 작용 용량의 잠재적인 오해를 극복합니다. 여기에 소개된 모델과 기술은 리포푸신 생성 및 제거 경로와 추정 독성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
망막 색소 상피(RPE)는 광수용체 외부 세그먼트 팁 또는 단편의 일일 흡수 및 분해를 포함하여 위에 있는 광수용체에 대한 중요한 지원을 제공합니다(이 프로토콜 전체에서 약어 OS는 전체 외부 세그먼트가 아닌 OS 팁 또는 단편을 나타냄). 유사분열 후 RPE의 이러한 일일 섭취는 결국 포골리소좀 용량에 과부하를 일으키고 리포푸신이라고 하는 소화되지 않는 자가형광 세포 내 물질의 축적으로 이어집니다. 흥미롭게도, 여러 연구에서 RPE 리포푸신이 OS 식균작용 없이 축적될 수 있음이 입증되었습니다 1,2. 리포푸신은 시각 주기 레티노이드에서 파생된 가교 부가물을 포함하여 많은 성분을 가지고 있으며 80세 이상의 경우 RPE 세포 부피의 거의 20%를 차지할 수 있습니다3.
리포푸신이 독성이 있는지 여부는 뜨거운 논쟁거리입니다. 스타가르트병은 ABCA4의 돌연변이가 광수용체 외부 세그먼트 내에 포함된 시각 주기 레티노이드의 부적절한 처리를 유발하는 광수용체 및 RPE의 상염색체 열성 변성입니다. 부적절한 레티노이드 처리는 비스-레티노이드 N-레티닐리덴-N-레티닐에탄올아민(A2E)을 포함한 비스-레티노....
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프로토콜
인체 조직의 획득 및 사용과 관련된 현재 프로토콜은 University of Michigan Institutional Review Board(HUM00105486)에 의해 검토 및 승인되었습니다.
1. 광산화된 외측 세그먼트 팁 및 단편의 제조
참고: 어둠에 적응한 소 망막은 구입하여 얼음 위에서 배송했습니다( 재료 표 참조). 이들 망막으로부터, OS는 이전에 공개된 프로토콜23에 따라 정제되었다.
- UV 램프를 사용한 외부 세그먼트 가교
- 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅 슬라이드( 재료 표 참조)를 70% 에탄올에 10분 동안 완전히 담그고 생물 안전 캐비닛에 넣어 슬라이드를 살균합니다. 슬라이드를 멸균된 100mm 세포 배양 접시에서 자연 건조시킵니다.
- 각 슬라이드를 하나의 새로운 100mm 세포 배양 접시에 넣고 200μL의 혈청 함유 세포 배양 배지(RPE 배양에 일반적으로 사용되는 배지)를 각 직사각형에 추가한 다음 전구가 슬라이드를 직접 향하도록 하여 휴대용 254nm UV 광선(재료 표 참조)을 100mm....
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결과
OS의 광산화를 위한 설정은 그림 1Ai에 나와 있습니다. 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅 슬라이드는 슬라이드의 나머지 부분에 퍼지지 않고 열린 직사각형당 많은 양의 OS 용액을 로드할 수 있습니다. OS가 있는 슬라이드는 뚜껑이 벗겨진 멸균 페트리 접시 안에 들어 있으며 UV 램프는 그림 1Aii와 같이 슬라이드 위에 놓입니다. 대안적으로, 슬라이드는 도 1Aiii에 도시된 바와 같이 UV 가교결합제 장치에 배치될 수 있다. 광산화 후 OS 자가형광은 현미경과 유세포 분석으로 평가한 바와 같이 크게 증가합니다(그림 1B). 광산화 후 단백질 가교 정도는 쿠마시 염색을 사용하여 SDS-PAGE로 평가할 수 있으며, 이는 우성 단백질 밴드(단량체 로돕신)가 고차 응집체 및 도말로 전환되는 것으로 표시됩니다(
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토론
RPE 리포푸신은 수십 년 동안 연구되어 왔지만 그 독성은 2,9,16,42에 대해 논의되고 있습니다. 동물 모델11에서 리포푸신의 독성에 대한 모호성을 감안할 때, 인간 RPE를 사용하는 시험관 내 모델은 가치가 있다. 다양한 시험관 내 리포푸신 축적 모델이 설명되었지만 OS 공급과 고도로 성숙하고 차별화된 인간 RPE 배양을 모두 활용한 모델은 없습니다. 이 조합은 OS 공급이 생체 내에서 리포푸신 축적 방법을 요약하고 고도로 성숙한 인간 RPE 배양이 생체 내에서 RPE 거동을 가장 잘 복제하기 때문에 이상적인 모델을 나타냅니다. 흥미롭게도, 고도로 분화된 hfRPE 배양을 이용할 때, 반복.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 유리체-망막 수술 재단(VRSF), 시력을 위한 싸움(FFS) 및 국제 망막 연구 재단(IRRF)의 보조금으로 부분적으로 지원됩니다. J.M.L.M.은 현재 국립 안과 연구소(National Eye Institute, EY033420)의 K08 보조금으로 지원되고 있습니다. HFT 연구에는 연방 기금이 사용되지 않았습니다. 제임스 그로스펠드 이니셔티브(James Grosfeld Initiative for Dry AMD)와 바바라 던(Barbara Dunn), 디 앤 딕슨 브라운(Dee & Dickson Brown)의 개인 기부자들의 지원이 더욱 지원된다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100mm 세포 배양 접시 | Corning | #353003 | 다른 사람들도 |
| 작동합니다 24-well Transwells | Corning | #3470 | |
| Anti-LC3 항체 | 세포 신호 기술 | #4801S | 1:1000 희석 |
| Anti-rhodopsin 항체 1D4 | Abcam | #5417 | 1:1000 희석. 에피토프는 C 터미널입니다. |
| 항로돕신 항체 4D2 | EnCor Biotech | MCA-B630 | 웨스턴 블롯에 대한 1:5000 희석, 면역 염색에 대한 1:1000 희석. 에피토프는 N-터미널입니다. |
| 자가형광 소광제 | Biotium | #23007 | TrueBlack Lipofuscin 자가형광 소광제 |
| 소광제 Vector | Laboratories | SP-8400 | Vector TrueVIEW 자가형광 소광제 키트 |
| Bodipy 493/503 | Life Technologies | D3922 | |
| 콜레스테롤 소광효소 | Life Technologies | From A12216 키트 | |
| 컨포칼 현미경 | Leica | Leica Stellaris SP8 with FALCON 모듈 | |
| Dark-adapted bovine retinas | W. L. Lawson Company | Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) | 연락처 정보 : https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com |
| Filipin | Sigma-Aldrich | F4767 | |
| 유세포 분석기 | Thermo Fisher | Attune NxT | |
| 유세포 분석기 분석 소프트웨어 | BD | FlowJo | |
| 핸드헬드 UV 라이트 | Analytik Jena US | UVGL-55 | |
| Human MFG-E8 | Sino Biological | 10853-H08B | |
| Human purified Protein S | Enzyme Research Laboratories | HPS | |
| Laemmli sample buffer | Thermo Fisher | J60015-AD | |
| LDH assay | Promega | J2380 | LDH-Glo 세포 독성 분석 |
| 마운팅 미디어 | Invitrogen | P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Nile red | Sigma-Aldrich | #72485 | |
| 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅 슬라이드 | Tekdon | 맞춤형 | 사양: 다음 "컷아웃"이 있는 PTFE 마스크 - 각각 17mm x 9mm 크기의 3개의 유리 직사각형, 17mm 면이 슬라이드 상단에서 4mm, 슬라이드 하단에서 4mm가 되도록 방향, 25mm x 75mm의 표준 현미경 슬라이드를 가정합니다. 각 사각형은 다른 사각형 및 슬라이드 가장자리에서 최소 6mm 떨어져 있습니다. 슬라이드에 PTFE 마스크를 인쇄하고 한쪽 면에 젖빛 유리가 있는 슬라이드에 인쇄하여 슬라이드에 라벨을 붙일 수 있도록 합니다. |
| 프로테아제 억제제 | 세포 신호 전달 기술 | #5872 | |
| 단백질 분석 | Bio-Rad | #5000122 RC DC 단백질 분석 | |
| TEER 전극 | World Precision Instruments | STX3 | |
| Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter | World Precision Instruments | EVOM3 | |
| 자외선 가교제 장치 | Analytik Jena US | UVP CL-1000 |
참고문헌
- Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
- Boulton, M. E.
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재인쇄 및 허가
