잘 보존된 미세 구조를 가진 단백질 국소화 분석을 위한 세포에서 EM-Visible Gold Nanoparticles의 직접 합성

Zhaodi Jiang

doi:10.3791/65246

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방법 논문

잘 보존된 미세 구조를 가진 단백질 국소화 분석을 위한 세포에서 EM-Visible Gold Nanoparticles의 직접 합성

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DOI:

10.3791/65246

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2023년 4월 28일

Zhaodi Jiang¹^,²

¹National Institute of Biological Sciences, Beijing, ²Tsinghua Institute of Multidisciplinary Biomedical Research, Tsinghua University

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 새로운 자가핵형성 억제 메커니즘 기반 금 나노입자 합성 기술을 사용하여 세포에서 메탈로티오네인 태그가 부착된 단백질을 검출하기 위한 클로너블 전자 현미경 표지 기술을 설명합니다.

초록

미세 구조적 분해능으로 세포에서 단백질 분자의 정확한 국소화를 분석하는 것은 모든 살아있는 유기체의 다양한 생리학적 또는 병리학적 과정을 연구하는 데 매우 중요합니다. 따라서 전자 현미경 프로브로 사용할 수 있는 복제 가능한 태그의 개발은 형광 단백질이 광학 이미징 분야에서 중요한 역할을 한 것처럼 큰 가치가 있습니다. 자가핵형성 억제 메커니즘(ANSM)이 최근 밝혀졌으며, 이는 메탈로티오네인(MT) 및 부동액 단백질(AFP)과 같은 시스테인이 풍부한 태그에서 금 나노입자(AuNP)의 특이적 합성을 가능하게 합니다.

ANSM을 기반으로 전자 현미경 표지 기술이 개발되어 전례 없는 표지 효율로 원핵 및 진핵 세포에서 태그가 부착된 단백질을 특이적으로 검출할 수 있습니다. 이 연구는 미세 구조가 잘 보존된 포유류 세포에서 MTn(알데히드 반응성 잔기가 없는 조작된 MT 변이체) 융합 단백질을 검출하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜에서, 고압 동결 및 동결 치환 고정은 비-알데히드 고정제(예: 탄닌산, 우라닐 아세테이트)를 사용하여 수행되었으며, 이는 거의 천연 미세 구조를 보존하고 알데히드 가교결합으로 인한 태그 활성의 손상을 방지하였다.

ANSM계 AuNP 합성 전에 간단한 1단계 재수화를 사용하였다. 그 결과 태그된 단백질이 소포체(ER)의 막과 내강을 포함한 다양한 세포 소기관을 표적으로 삼고 미토콘드리아 매트릭스가 높은 효율과 특이성으로 검출되는 것으로 나타났습니다. 이 연구는 생물학자들에게 세포 미세 구조적 맥락에서 단일 분자 수준에서 방대한 범위의 생물학적 문제를 해결할 수 있는 강력한 프로토콜을 제공합니다.

서론

포스트 게놈 시대에 광학 현미경을 위한 단일 분자 리포터로서 녹색 형광 단백질(GFP)의 개발은 현대 생명 과학 연구 분야에 혁명을 일으켰습니다 ^1,2. 수십 년 동안 전자 현미경(EM)은 나노 해상도³으로 세포 미세 구조를 직관적으로 관찰할 수 있는 강력한 도구였습니다. 그러나 단백질 분자의 정확한 식별과 국소화는 여전히 어려운 과제입니다.

가장 일반적으로 사용되는 EM 표지 기술은 항원-항체 반응을 기반으로 하는 면역전자 현미경(IEM) 표지 기술입니다. 그러나 IEM 사전 임베딩 및 IEM 사후 임베딩(수지 절편 또는 수화 극저온 절편)을 포함하여 IEM 라벨링 분야에서 많은 기술이 개발되었지만 여전히 낮은 라벨링 효율(<10%)^4,5^, 이는 샘플 준비 및 항체 품질과 관련이 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 유전적으로 암호화된 태그를 개발하는 것은 큰 응용 가능성을 가지고 있습니다.

최근 몇 년 동안 두 가지 주요 유형의 EM 태그....